猪瘟病毒阳性血清的热加速稳定性试验

戴志红，蒋 卉，李 翠，张秀英，温 芳，陆连寿，孙海燕，魏 津，关孚时，王在时

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一种高度接触性、致死性的猪传染病，在世界上很多国家(地区)［1－2］包括我国［3－4］均有发生，给畜牧业生产带来了严重的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将猪瘟列为法定通报性疫病［5］，我国将其划为一类动物传染病［6］，并纳入重大动物疫病防控计划。猪瘟病毒抗体检测是猪瘟诊断、免疫效果评价和流行病学调查的重要手段，但其敏感度和准确性易受方法、人员、试剂、实验动物等诸多因素影响。猪瘟病毒阴、阳性血清国家参考品则是控制和校准猪瘟抗体检测的实物“标尺”，但我国目前尚缺乏猪瘟病毒阴、阳性血清国家参考品。为了研制该参照品，本研究对制备的1批猪瘟病毒阳性血清进行了热加速稳定性试验，以考察冻干工艺与产品的贮存有效期是否符合预期。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 猪瘟病毒阳性血清 猪瘟病毒阳性血清，经过滤分装至1 mL长颈安瓿(每支分装1 mL)，冻干、抽真空后熔封，计1000支，由中国兽医药品监察所制备(批号200905－3)。

1．1．2 试剂 猪瘟抗体 ELISA检测试剂盒(Lot No．43220－T761)，Idexx公司。

1．2 方法

1．2．1 试验方案 采用经典恒温热加速稳定性实验，从几个较高温度下样品的效价失活情况计算其在较低温度下的贮存有效期。随机抽取40支血清样品，分别在 25、37、45、56 ℃下保温，分别于 0、1、2、3、4、8、12、24 周随机抽取1 支样品，按照 1 ∶400、1∶450～1∶800系列稀释，每个稀释度重复3孔，用猪瘟抗体ELISA检测试剂盒检测其效价(最大阳性稀释倍数)(注:尽量在同条件下、在同一酶标仪上检测)。

1．2．2 不同温度下的失活速率常数k的计算 大部分蛋白质或生物制品的活性失活基本上都符合一级反应动力学［7－8］。一级反应的速率方程(公式1)为:ln c=ln c0－kt，式中的 c为效力值(或其他活性单位值)，c0为初始效力值，k为失活速率常数，t为时间。将不同温度下的加速稳定性数据按公式1拟合线性回归方程，据此求出不同温度下的k值。

1．2．3 －20℃下失活速率常数k的计算 不同温度的失活速率常数k与温度的动力学关系符合Arrhenius方程［9］(公式 2):ln k= － Ea/RT+ln A，T为绝对温度，R为摩尔常数，Ea为活化能，A为指前因子。将25、37、45、56℃下失活速率常数 k按公式2拟合出线性回归方程，据此求出－20℃下的k值。

1．2．4 －20℃下贮存有效期的计算 根据－20℃下的失活速率常数k及公式1，即可计算出样品效价由初始效价降低到目标效价所需的时间，即为该样品的贮存有效期。

1．2．5 持续稳定性监测 随机抽取－20℃下保存1年后的制品5支，按1．2．1项方法测定其效价，以后每隔一定时间监测一次。

2 结果

2．1 不同温度下的热加速试验结果 血清在25、37、45、56℃时的热加速试验结果与预期相符，保存温度越高，效价下降速度越快(表1)。

表1 不同温度下的热加速试验结果

2．2 不同温度下的失活速率常数k 将不同温度下的热加速稳定性数据按公式1拟合出线性回归方程(图1)，结果R2值均大于0．95，相关性良好，得出了不同温度下的k值。

2．3 －20℃下失活速率常数k 将25、37、45、56℃下失活速率常数k按公式2拟合出线性回归方程(图2)，据此求出 －20 ℃下的k值为5．874 ×10－5。

2．4 －20℃下的贮存有效期 根据－20℃下的失活速率常数k及公式1，计算出样品效价由初始效价1∶800降低到95%(即1∶760)所需的时间为16．8 年。

2．5 持续稳定性监测 结果显示，5支样品的ELISA效价均为1∶800，制品活性未发生明显下降，与热加速稳定试验预期一致。

图1 不同温度下效价随时间变化拟合线性回归

图2 不同温度下k值拟合线性回归

3 讨论

通常在较低的保存温度下(2～8℃或－20℃)生物制品的失活速度很慢，加之生物制品活性出现的细微下降不易被非常准确地测定，因此在较低温度下，研究者往往很难在短时间内(几周以至几个月)根据生物制品的失活数据和公式1得到比较准确的k值，从而计算制品在该温度下的贮存有效期。而生物制品在较高温度下的失活速度很快，利用Arrhenius方程和几个温度下的加速失活数据，则可以从较高温度下的k值估算较低温度下的k值，再根据k值和公式1预测制品在低温保存条件下的稳定性。因此，热加速稳定性试验可以在较短时间内比较准确地预测制品在某温度下的贮存有效期。

3．1 热加速温度点的选择 根据Arrhenius方程拟合线性回归必须至少要有3个温度点的k值，因此热加速稳定试验选择的温度点要在3个以上。此外，要根据制品在几个温度点下的失活数据和公式1拟合线性回归得到比较准确的k值，则需要科学选择试验的温度点，要求温度点之间有较大间隔并且制品在这些温度点下失活速度较快而又不能过快，以保证拟合线性回归的相关系数较好(一般要求R2≥0．95)。若温度点间隔较小，则k值随温度变化不明显，会导致拟合线性回归不理想;若温度太高以致失活太快，则该温度下失活的有效数据太少，也会导致拟合线性回归不理想。如拟合线性回归失败或不理想，可以适当调整试验温度。本试验选择25、37、45、56℃为温度点，结果拟合线性回归的R2均大于0．95，说明温度点的选择是合适的。

3．2 测定方法的选择 热加速稳定性试验所选择的测定方法需要有足够的灵敏度、精密度和重复性。此外，还需保证每个温度下的测定次数(至少3次)，因此测定时需选择适当的时间间隔，可先在热加速初期密集测定，再根据下降趋势调整测定频率。本试验选择ELISA检测方法，并且由同一操作者在同一实验室用同一仪器尽量按照相同条件完成测量，保证了较佳的测定条件，并且试验成本较低。在每个温度下测定次数的选择上，本试验采取了先密后疏的策略，在热加速初期每周测定1次，后来逐渐加大了测定之间的时间间隔，这样既能检测到效价的细微下降，又能检测到大的下降趋势，也保证了总的测定次数。结果显示，拟合线性回归的相关系数较好，说明测定方法的选择和测定时间间隔的安排也是合理的。

3．3 持续稳定性监测 由于生物制品本身的复杂性，加之温度点的选择、每个温度点的测定次数和每次测定的样品数量有限，用热加速稳定性试验预测制品的贮存有效期也必然存在一定局限性，仍不能完全替代持续稳定性研究，预测值和实际值之间的偏差也有很大的不确定性。因此，用热加速稳定性试验预测标准物质的贮存有效期，可以用于可能影响标准物质稳定性的工艺和环节的筛选和研究，也可以方便估算标准物质在多个温度下的有效期供参考，在标准物质实际提供使用后，仍需定期或不定期进行持续稳定性监测，以确实保证标准物质的有效性。

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［5］ http://www．oie．int/eng/maladies/en_classification2010．htm?e1d7［2010 －1 －4］．

［6］ 中华人民共和国农业部．中华人民共和国农业部公告第1125号［S］．

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