犬细小病毒抗体效价监测与疫苗免疫效果分析

秦海斌 温 海 贺星亮 陈 杨 张汇东

近几年，伴随着犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV) 毒力、宿主嗜性(犬、猫)等生物学特性的变化，免疫犬感染不同亚型病毒的报告屡见不鲜，尤其在规模化犬场内，CPV的感染比例仍居高不下，一段时期内甚至会出现急剧增高的趋势，为调查这些异常的流行病学状况，我们在本地区多个养殖场内随机选择了514头犬进行了抗体效价监测，并结合其免疫日龄、疫苗种类等因素，从血清学角度分析了首免时间、疫苗品质对免疫效果的影响，并对本地区的规模化养殖场的细小病毒免疫状况进行了综合分析，现将结果报告如下。

一、材料和方法

（一）主要材料

血凝抗原为犬细小病毒CPV-GN株，由公安部南京警犬研究所分子生物学实验室分离、致弱、保存；F81细胞株，购自中科院上海细胞生物研究所，用于病毒株的传代和培养；犬血清采集自南京地区多个规模化养殖场，供血犬至少用进口疫苗免疫过两次，当年秋季免疫后采血分离，分装保存于-20℃；猪红细胞，采自6月龄健康长白猪，在阿氏液(Alsever’s)中4℃保存，实验前以20倍量的0.2mol/L PBS洗涤3次，1000r/min离心10min后取红细胞配成1%悬液备用。

（二）试验方法

血凝/血凝抑制试验:参照国标GB/T14926.53-2001与GB/T14926.54-2001进行。CPV-GN株病毒经F81细胞株培养培养4天后收获病毒，反复冻融3次后3000r/min离心30min去除细胞碎片，然后10000r/min离心30min，取上清液作为血凝抗原，血凝效价(HA)为29。犬血清在试验前，以57℃恒温震荡30min灭活补体，然后用高岭土处理血清去除非特异性凝集素。

为比较初免日龄对和不同商品化疫苗的免疫效果，随机选择24头仔犬，分4组每组6头，分别在35日龄、40日龄、45日龄、50日龄进行首次免疫，在28日后加强免疫一次，分别记录第0、7、14、21、28、35、42天时的抗体效价，评价不同首免日龄的免疫效果。

选择目前使用比较广泛的商品化疫苗：W五联（Ⅰ组）、IN二联（Ⅱ组）、IN四联（Ⅲ组）、H四联苗（Ⅳ组）进行对比试验，随机挑选16头仔犬分为四组，于45日龄进行首免，14天加强免疫，并自首免后的0、7、14、21、28、35、42天进行血清效价检测，评价不同品牌疫苗的免疫效果。

在秋季免疫之后，随机选择不同犬场不同品种和年龄的犬共计514头，采集静脉血并分离血清， HA/HI试验测定效价，总体评价犬群的免疫效果。

二、结果

（一）首免日龄的选择

不同时间测定的血清效价数据以x±SE表示，用SPASS软件进行Duncan’s方差分析和多重比较，显著水平为P＜0.05。以45日龄首免作为参照组，在接种前D0，其他3组与参照组（45d）差异不显著；D7天，50日龄免疫组效价显著高于前两组，与对照组（45d）无差异；D14天，前3组效价差异不明显，但高于50日龄首免组；D21、D28,四组数据差异不明显；D35天，参照组（45d）效价显著高于其他组，其他组无差异；D42天，50日龄与参照组（45d）差异不显著，但是明显高于前两组。综合上述数据可以看出，以45日龄和50日龄作为首免时间，不同时期的效价明显高于30和40日龄首免组，且50日龄组在加强免疫后效价高于参考组（45d），可作为最佳的首次免疫时间。

（二）疫苗种类的选择

不同时间测定的血清效价数据以x±SE表示，用SPASS软件进行Duncan’s方差分析和多重比较，显著水平为P＜0.05。首免后7天（D7）进行第一次效价测定，Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ组效价升高但无显著差异，Ⅲ组效价显著低于其他组；D14天，Ⅱ、Ⅳ组效价显著高于Ⅰ、Ⅲ组；D21天，加强免疫后Ⅰ、Ⅱ组抗体效价降低，Ⅲ、Ⅳ组效价升高；D28天，Ⅱ组效价显著高于Ⅲ组，与Ⅰ、Ⅳ组差异不显著；D35天，前三组效价无差异，第Ⅳ组效价明显高于前三组；D42天，Ⅱ、Ⅳ组效价显著高于Ⅰ、Ⅲ组。综合上述不同时间的效价测定结果，可见Ⅱ组的免疫效果略优于其他小组；另外，无论选用那种疫苗，在经过二次加强免疫之后，抗体均能升高到保护效价之上，说明目前商品化疫苗的质量优良。

表1 幼犬不同首免日龄对CPV抗体效价（log2）的测量结果

表2 幼犬不同种类疫苗对CPV抗体效价（log2）的影响

（三）抗体监测与评价

HA/HI结果显示，514份样本中，效价为27的样本有2个，效价为28的样本57个,效价为29的79个,效价为210的70个，效价为211的63个，效价为212的116个，效价为213的87个，效价为214的31个，效价为215的9个。最低效价27，最高效价215，加权感染CPV、首免后仔犬在免疫后窗口期内发生CPV感染、个别二次免疫后的成年犬感染，排除疫苗质量的因素，这与幼犬的母源抗体水平、疫苗首免后抗体的产生时间、加强免疫后抗体维持时间三个方面密切相关，因此，我们着重调查了疫苗的首免时间、疫苗种类对免疫效果的影响，并通过检测514份血清的效价，总体评价了疫苗的免疫效果。数据显示，现有商品化疫苗均能够刺激犬体产生良好的体液免疫反应；与现在常用的在45日龄首次免疫相比，在50日龄进行首次免疫效果更佳，证明幼犬体内母源抗体维持时间较长，在45日龄时母源抗体仍能对初次免疫产生一定影响，从初次免疫前的幼犬进行的抗体效价检测数据也可以得出相同的结论。另外， CPV感染只在HI低于1:80时发生，抗体高于1:160时犬有可能出现隐性带毒而不表现明显临床症状；当效价高于1:640时能够达到完全保护。本次对成年犬抗体平均效价为211.2。

表3 不同效价时的犬的数量

三、讨论

过去30年，世界范围内的细小病毒虽然处于不断进化之中，但其衣壳蛋白的主要抗原位点并未发生很大的变化。理论上讲，不论哪种新毒株，现有的疫苗均可提供良好的保护力，而且不需要每年重复接种，数年后是否需要重复接种，则依赖于血清学检测结果。但另一方面，疫苗免疫后的犬再次感染不同亚型病毒的病例也时有出现，欧洲以新型病毒株制造的疫苗已经获得许可，这说明无论在生产实践还是在科学研究中，疫苗的保护效果并非高枕无忧，不断进化的新型病毒必须依赖研发新的商品化疫苗进行防控。

我们对南京地区进行CPV血清学调查，是基于目前疫病防控中出现的一些异常状况，例如未免疫幼犬整窝普查结果显示，效价低于1:80的样本数为零，低于1:160的样本数为2，低于1:640的样本数合计为138例，整体免疫合格率为100%，但仍有26.8%（138/514）的犬处于完全保护的抗体水平之下，存在一定的感染风险，尤其是新的亚型病毒出现之后，不同亚型病毒的交叉保护能力已经发生了变化，感染风险也会逐渐增加。

另外，一种疫苗的保护力不可能达到100%的理想状态，群体中个体免疫力差、免疫系统异常及其他免疫抑制因素都是存在的，这些因素均会造成一定比例的犬处于感染风险之中，通过合理的免疫程序、加强饲养管理、适时监测抗体效价等方式对于提高犬群的整体免疫防控效果具有很好的作用。