氟苯尼考粉中非法添加四种喹诺酮类药物的HPLC检测方法研究

方忠意，班付国，周红霞，马 俊，刘占通

(河南省兽药监察所，郑州 450008)

喹诺酮类药物是一类人工合成具有4－喹诺酮环结构的药物，因其具有抗菌谱广、杀菌力强、吸收快、体内分布广泛、不良反应小和与其他抗菌药无交叉耐药性等特点，被广泛应用于治疗动物各类感染［1－3］。目前有部分兽药企业为了提高其产品的疗效，在氟苯尼考粉中添加喹诺酮类药物，这种行为容易造成药物在动物源性食品的残留、诱导畜禽耐药菌的产生，最终危害人体健康。本研究旨在建立高效液相色谱法测定氟苯尼考粉中非法添加喹诺酮类药物的定性定量检测方法。

1 材料

1．1 仪器设备 Waters超高效液相色谱仪(带二极管阵列检测器);MILLIPORE超纯水仪;METTLER XP205电子天平;HANNA pH211C酸度计。

1．2 药品与试剂

1．2．1 对照品 氧氟沙星对照品，批号H0090912，含量 98．2%;诺氟沙星对照品，批号H0080904，含量99．8%;盐酸环丙沙星对照品，批号 H0100803，含量100．0%;恩诺沙星对照品，批号H0080904，含量 99．8%;氟苯尼考对照品，批号K0301004，含量 99．3%;甲砜霉素对照品，批号K0241009，含量99．7%。均由中国兽医药品监察所提供。

1．2．2 原料药 氧氟沙星、盐酸环丙沙星和恩诺沙星原料药由河南新正好生物工程有限公司提供，乳酸诺氟沙星由河南亚卫动物药业有限公司提供。1．2．3 试剂 磷酸，分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司;三乙胺，分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司;乙腈，色谱纯，Sigma公司;甲醇，色谱纯，Sigma公司;水由实验室MILLIPORE超纯水仪自制，符合实验室一级水要求。

1．2．4 供试品

1．2．4．1 阴性对照氟苯尼考粉 由普莱柯生物工程股份有限公司提供，规格为100 g∶10 g，质量符合《中华人民共和国兽药典》二〇一〇版一部质量标准，经检测不含氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星。

1．2．4．2 阳性添加氟苯尼考粉 考虑到阳性添加试验需要4种喹诺酮类药物的量较多，本试验使用兽药原料药代替标准物质进行试验，即在阴性对照氟苯尼考粉中分别添加氧氟沙星、乳酸诺氟沙星、盐酸环丙沙星和恩诺沙星原料药，混匀，共添加3个含量，分别为1%、2%和5%。

2 方法与结果

2．1 溶液的制备

2．1．1 对照品溶液的制备 取氧氟沙星、诺氟沙星、盐酸环丙沙星和恩诺沙星对照品约10 mg，分别于10 mL量瓶，精密称定，加2%磷酸溶液－乙腈(1∶1)适量，超声15 min使溶解，放冷至室温后用2%磷酸溶液－乙腈(1∶1)定容至刻度，摇匀，制成1 mg/mL的标准品贮备液。分别取甲砜霉素和氟苯尼考对照品约10 mg于50 mL量瓶，精密称定，加25%乙腈溶液溶解稀释至刻度。

2．1．2 供试品溶液的制备 分别称取1．2．4．2项下的阳性添加氟苯尼考粉1．0 g于50 mL容量瓶，加2%磷酸溶液－乙腈(1∶1)适量，超声15 min使溶解，放冷至室温后用2%磷酸溶液－乙腈(1∶1)定容至刻度，摇匀;精密量取5 mL于50 mL容量瓶，加流动相A至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2．2 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱为XBridgeTMC18(5 μm，4．6 mm ×150 mm)柱;以A(磷酸3．0 mL加水至1000 mL，用三乙胺调pH值至3．0±0．1，加乙腈50 mL)－ 甲醇(88 ∶12)为流动相，采用二极管阵列检测器检测，采集波长为200～400 nm，分辨率为 1．2 nm;记录光谱图和283 nm波长处的色谱图。分别精密量取2．1．1项下的氧氟沙星、诺氟沙星、盐酸环丙沙星、恩诺沙星对照品溶液、甲砜霉素对照溶液和氟苯尼考对照溶液适量，配制成50μg/mL的混合标准溶液，量取10μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图。该条件下，提取234 nm处的色谱图，按出峰时间先后顺序依次是甲砜霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、氟苯尼考和恩诺沙星，相邻色谱峰的分离度符合要求，结果见表1，有关色谱图和光谱图见图1～图3。

表1 系统适用性试验数据

图3 4种喹诺酮类药物的光谱图(从上到下依次是氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星)

2．3 线性范围 精密量取2．1．1项下4种喹诺酮类药物的标准品贮备液适量，用流动相A稀释成0．25、0．5、1、2、5、10、20、50、100、200 μg/mL 的系列混合标准溶液，从低浓度到高浓度依次进样，按照2．2项下的色谱条件进样分析，以标准溶液浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，求得线性回归方程及相关系数(表2)。结果表明，4种喹诺酮类药物的浓度在0．5～200μg/mL范围内呈良好的线性关系。

表2 4种喹诺酮类药物的线性方程和相关系数

2．4 添加回收试验 按1．2．4．2项下方法制备阳性添加样品，每个添加含量做5份平行样，按2．1．2项下方法制备供试品溶液。同时参照2．1．1项下标准溶液方法用氧氟沙星、乳酸诺氟沙星、盐酸环丙沙星和恩诺沙星原料药制成适当浓度的对照溶液，用于回收试验的定量计算。按照外标法定量，本实验的回收率为98．5% ～100．9%，相对标准偏差为0．14% ～0．74%，结果见表3。

表3 4种喹诺酮类药物的回收率及相对标准偏差

2．5 检测限 将2．1．1项下的4种喹诺酮类药物的贮备液制成混合标准溶液，进行梯度稀释后添加到阴性对照氟苯尼考粉中，按2．2项下的方法进行检测，光谱未失真的最低添加含量作为检测限。本方法的检测限为0．5 mg/g。

2．6 专属性试验 取系统适用性实验的混合标准溶液进行试验，采用二极管阵列检测器检测，4种喹诺酮药物能够很好地分离，氟苯尼考粉中氟苯尼考及其类似物甲砜霉素均不干扰喹诺酮类药物的检测。

3 讨论

3．1 喹诺酮类药物在多数溶剂中溶解性差，一般根据喹诺酮类药物在不同pH介质中的溶解性来设计具有一定选择性的溶解或提取方法［4］。由于兽药样品一般溶解稀释后可直接进行分析，考虑到喹诺酮类药物的化学性质和反相色谱流动相的特点，本研究选择2%磷酸溶液和乙腈的混合溶液作为溶解液，既能够很好的溶解喹诺酮类药物，而且跟后续的稀释和HPLC分析的流动相兼容性很好。喹诺酮类药物具有两性基团，属于两性化合物，反相色谱分析时通常选择酸性溶液作为流动相，从而抑制色谱峰的拖尾。本研究比较了多款色谱柱和流动相体系，最终选择了酸性流动相体系和Waters公司的杂化颗粒为载体的XBridgeTMC18色谱柱，能在较短的时间内很好地分离了4种喹诺酮类药物、氟苯尼考及其类似物，各色谱峰之间的分离度均满足要求，而且色谱峰的峰形比较对称。研究过程中发现流动相A中乙腈的量要控制准确，乙腈含量过高导致氧氟沙星和诺氟沙星难以充分分离，乙腈含量过低导致各色谱峰出峰严重滞后，影响检测效率。

3．2 本研究采用二极管阵列检测器进行检测，旨在定性定量同时进行。4种喹诺酮类药物在200～400 nm范围内有特征性的吸收光谱，通过吸收光谱和保留时间两个指标与标准物质进行比较，定性供试品中是否含有本研究中的4种喹诺酮类药物。诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的最大吸收波长比较一致，氧氟沙星的最大吸收波长与前三种药物的最大吸收波长差异较大，为了定量检测，本研究选择了283 nm处色谱图用于定量检测，能够较好兼顾4种药物均有较强的吸收。系统适用性试验中添加了氟苯尼考和甲砜霉素两种物质，主要是研究过程中发现，氟苯尼考粉制剂中氟苯尼考及可能存在的甲砜霉素对目标化合物的色谱有干扰。选择234nm处的色谱图用于系统适用性判定，是因为在283nm处氟苯尼考和甲砜霉素两种物质吸收很弱，而在234nm处6种药物均有吸收，图1和图2为同一次进样不同波长的色谱图。

3．3 采用二极管阵列检测器检测药物中非处方成分，容易受到目标分析物以外的化合物的干扰，定性检测有一定的局限性。由于药品中的非处方成分是不可预料的，按照本方法中的色谱条件检测，也不可避免受到干扰，参考本方法检测时，若怀疑某种目标化合物受到干扰，建议通过改变色谱条件使目标化合物与干扰物完全分离或用质谱方法进行确证，以免造成误判。

［1］ 陈杖榴．兽医药理学［M］．北京:中国农业出版社，2007．

［2］ 孙 雷，朱馨乐，刘 琪，等．猪肉组织中7种氟喹诺酮类药物残留检测高效液相色谱－串联质谱法研究［J］．中国兽药杂志，2008，42(3):12 －15．

［3］ 张玉洁，李 倩，汪 霞，等．高效液相色谱法检测多种动物组织中氟喹诺酮类药物残留量的研究［J］．中国兽药杂志，2012，46(7):18 －22．

［4］ 李俊锁，邱月明，王 超．兽药残留分析［M］．上海:上海科技出版社，2002．