脱氧核酶在病毒学中的研究和应用

李 红，易建中

(上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106)

DNA在自然界中主要以双螺旋形式存在，被认为是一种被动分子，仅适合于编码和携带遗传信息，其结构及化学特征限制了本身具备其它功能的可能性，然而，随着体外分子进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)的发展，研究发现DNA也具有酶的活性，称为脱氧核酶(DNAzyme)。此项研究成果成为人类核酸研究史上的又一重大飞跃。

1 DNAzyme的体外获得

DNAzyme分子的体外选择是根据SELEX技术原理建立了以PCR为基础的体外“催化洗脱”筛选系统［1］。首先合成一个两端为固定序列，中间由50～100个随机核苷酸组成的多核苷酸单链DNA库。以该随机单链库为模板，一个RNA－DNA杂合分子为引物，经逆转录酶催化，将单链库转化成双链库。其由生物素基团结合于链亲和素柱上，经碱变性，洗脱下不含生物素的一条单链DNA，从而得到一个固化相的单链随机寡核苷酸库，再用根据设计目的选定的pH条件和离子缓冲液洗脱，如有切割反应发生，被切割的分子将被洗脱下来，再经PCR放大和亲和分离，又重新回到类似于原始库的随机库，继续进行第二轮选择。一般十轮以上就可获得具有催化活性的分子，然后再对功能分子进行克隆测序，并推理出其可能的二级结构。目前，通过这一技术已获得两种具有RNA裂解活性的脱氧核酶被筛选出来，它们是“8～17”和“10～23”(如图1)，分别是在第8循环的17克隆和第10循环的23克隆得到的，命名也由此而来。它们的结构由结合部位和催化部位组成，结合部位通过Watson—Crick碱基配对与底物RNA分子结合，而催化部位在RNA分子的一个未配对的嘌呤和一个已配对的嘧啶碱基处切割RNA。“10～23”脱氧核酶要求切割位点为嘌呤—嘧啶连接，“8～17”要求切割位点为AG连接。因此，在RNA灭活研究中“10～23”脱氧核酶更灵活，应用较多。同时，改变结合部位的碱基序列可作用于不同底物RNA靶分子。

在实际应用中，不必都经过上述筛选过程，研究者往往利用以前筛选获得的已知高催化活性的DNAzyme(如“10～23”型脱氧核酶)，保留其催化活性中心而对其侧翼识别序列结合特异性进行改造来满足不同的实验目的和靶位的需要。设计好的脱氧核酶可直接在核酸合成仪上大量合成。

图1 脱氧核酶“8～17”和脱氧核酶“10～23”

2 DNAzyme的特性

随着越来越多的脱氧核酶被筛选出，对其功能性质的研究也随之深入，发现脱氧核酶具有以下特性。

2．1 RNA切割作用 脱氧核酶最重要也是目前研究最活跃的一种性质，是通过酯化作用而切割RNA分子的功能。DNA这种独特的性质，使其有可能用于破坏体内细胞和病毒RNA，具有潜在的体内治疗作用。其发挥RNA切割作用有以下几种形式:1．以金属离子为辅因子，如二价金属离子(Mg2+，Pb2+，Zn2+，Mn2+，Ca2+，Cd2+)以及三价的稀土元素镧系金属离子((铽、铥、镧)。特别是Santoro等［2］筛选出的两个 Mg2+依赖的脱氧核酶“8～17”和“10～23”，能切割所有的 RNA 底物。2．以氨基酸为辅因子，Roch等［3］筛选出一个以L－组氨酸为辅因子的脱氧核酶，只有在L－组氨酸存在条件下才发挥RNA切割作用，而D－组氨酸不能有效促进脱氧核酶的切割功能，说明DNA能够形成精确的空间结构以识别底物分子和辅因子。另外精氨酸也可作为辅助因子。3．自身具有RNA切割作用，单链DNA分子在不需要任何辅助因子的条件下，依靠自身结构的变化而具有切割RNA的作用。Geyer等［4］用二价金属离子螯合剂EDTA排除二价金属离子的污染，并进行准确的微量金属分析，在确认没有二价金属离子或其它辅助因子存在的条件下，通过“催化洗脱”的方法筛选到一个具有RNA切割作用的脱氧核酶，命名为“G3”。与不加酶的反应相比，它提高催化效率108倍。此研究表明DNA分子自身也能提供具有活性的化学基团而发挥催化效应。

2．2 DNA切割作用 脱氧核酶不仅具有RNA切割作用，而且也能切割DNA分子。Carmi等［5］筛选出两类具有DNA自我切割作用的脱氧核酶，Ⅰ类自我切割脱氧核酶需要Cu2+和维生素C参与，而Ⅱ类脱氧核酶只需要Cu2+。多数脱氧核酶只能与底物形成二联体形式，而Ⅱ类脱氧核酶能与底物形成二联体或三联体形式，结合并切割DNA底物，通过改变二联体或三联体的识别位点，就可以切割不同核苷酸序列的单链DNA分子。

2．3 金属螯合作用和过氧化物酶活性 Li等［6］分离到一个DNA配基，能催化Cu2+和Zn2+螯合到卟啉环底物上，在随后的实验中，他们通过优化DNA配基序列和反应参数，提高了DNA配基的催化能力，筛选出一个只有24nt富含鸟嘌呤(G)的脱氧核酶“PS5M”。PS5M形成一个G四聚体结构的催化活性中心，结合一个扭曲的卟啉分子，使卟啉分子类似于金属螯合反应的中间过渡态，从而促进了金属的螯合作用。PS5M还能与血红素结合，形成的复合物具有过氧化物酶的活性，能催化氯高铁血红素－氢氧化物的分解［7］。

2．4 DNA激酶活性 脱氧核酶还具有类似T4多核苷酸激酶的作用，能把NTP或dNTP上的γ－磷酸基团转移到DNA的5’－OH上。Li等［8］从一个随机单链DNA库中筛选出50个不同序列类型的具有自我磷酸化作用的脱氧核酶，都能把NTP或dNTP上的γ－磷酸基团转移到DNA的5’－OH上，实现DNA分子5’－OH端自我磷酸化。通过优化反应条件，脱氧核酶还能区分NTP和dNTP。其中一个优化的ATP依赖的脱氧核酶能特异性地选择ATP，高出CTP、GTP及UTP 4000倍。

2．5 DNA 连接酶活性 Li等［9］从一个随机序列DNA库中筛选出12个具有连接酶活性的脱氧核酶，都能促进ATP依赖的自我“加帽”反应，即把ATP上的AMP基团转移到脱氧核酶自身的5’端磷酸基团上，形成5’，5’－磷酸连接，与T4 DNA连接酶活性相同。

2．6 高效性与高特异性 以Kcat/Km表示，脱氧核酶的催化效率在109mol－1·min－1左右，超过任何其它的核酶。不同设计目的筛选出的DNAzyme其催化效率一般均超过或不低于相同靶标的核酶。这是因为DNAzyme分子量较小，结构相对简单，受靶序列二级结构的影响较少，因此对底物的趋进性较好，在同等温度、离子强度等条件下其稳定性约为RNA的105倍，且DNA－RNA杂合分子较RNA－RNA杂合分子易于解离，故剪切速率受产物解离过程的影响少。一般而言，其催化效率取决于底物与酶结合的速率。酶—底物的结合亲和力决定于识别部位的序列长短，最佳序列长度在14～20核苷酸范围内。由于其底物识别臂特异性识别序列的长度可达18个碱基以上，因此特异性极高。

酶的作用具有高度专一性。这种专一性是酶—底物以 Watson－Crick碱基配对形式，Santoro［11］在脱氧核酶的结合臂的不同部位引入点突变，研究单碱基错配对切割活性的影响时发现，任何部位与形式的单碱基错配都很大程度损坏了脱氧核酶的切割活性。这表明脱氧核酶在识别靶位点进行切割时具有很强的特异性。另外，Wu［12］使用不对称结合臂(6/12 bp)，进一步提高了切割特异性。

3 DNAzyme在病毒感染性疾病方面应用

3．1 HIV病毒的研究 1997年，Santoro等就设计出了可特异性切割HIV－1病毒mRNA起始密码区(gag/pol，env，vpr，tat和 Nef)的 DNAzyme;Banerjea等［13］应用“10 ～23”和“8～17”两种催化模序，建立了鉴别靶标RNA切割位点的方法。针对HIV－1病毒基因5’末端顺式激活反应元件(TAR)筛选出许多切割位点用于抑制病毒的复制，研究发现，无论是降解全长还是短片段的靶位点，“8～17”催化模序最为有效。作者认为由于HIV－1病毒基因的TAR区在功能上是十分保守的，因此这种抑制效应对一系列分离株都会有效。以“10～23”DNAzyme为模板，Unwalla等［14］设计了多种针对HIV病毒TAT和TAT－REVRNA的DNAzyme，通过筛选发现其中Dz－5970可在模拟生理状态下高效切割靶RNA，抑制率高达90%，并且在导入细胞后仍然保持较高活性。Wengel等［15］发现了一个锁核酸/DNA低聚体，可以剂量依赖方式抑制HIV－1病毒Tat蛋白介导的顺式激活作用，利用锁核酸单体修饰后的“10～23”DNAzyme显著增强切割RNA的活性。鉴于以脂质体载体导入哺乳动物细胞在活性应用中的可操作性很差，研究者［16］利用鸟嘌呤残基可直接与巨噬细胞表面清道夫受体相互作用的能力，合成了一种在3’末端包含10个G残基的 DNAzyme 5970，经过这种改造的DNAzyme可不需要载体而被巨噬细胞特异性摄入，并能够特异性切割 HIV－1 TAT/Revd的编码RNA，从而有效抑制细胞内HIV－1病毒的基因表达。该实验为DNAzyme应用于活体治疗的实用性提供了方法学依据。

3．2 肝炎病毒的研究 针对乙肝病毒s基因开放读码框第157位的AUG和e基因开放读码框第1816位AUG设计的脱氧核酶DrzBS与DrzBC，可在0．1～2．5mmol/L范围内以剂量依赖方式特异性抑制相应病毒基因的表达，最大抑制效率分别可达94．2%与91．8%［17］。研究发现 DNAzyme 对 HBsAg和HBeAg的抑制效果远远高于反义寡核苷酸，并且其有效浓度至少低于反义寡核苷酸10倍。在高效抑制靶标基因的同时没有发现明显的细胞毒性，作者认为是一种有效的抗乙肝病毒治疗方法。此外于乐成以“10～23”DNAzyme催化基序设计的针对丙型肝炎病毒(HCV)5’非编码区几部分C区(RNA 5’－NCR－C)的 DNAzyme用于治疗HCV感染，也观察到了较好的抑制效果。

3．3 其他病毒的研究 应用“10～23”DNAzyme设计的可特异性切割人呼吸道合胞病毒(respiratory syncytialvirus，RSV)基因组中NS2基因起始位点的脱氧核酶DZ604，可有效抑制RSV病毒基因组RNA的复制，研究者利用电子显微镜在形态学水平上(致细胞病变效应和细胞超微结构改变)，观察到DZ604对RSV的切割抑制效应呈剂量依赖的方式，当使用5 mmol/L 浓度时，可减少病毒产量的85．56%［18］。

Schubert等［19］以“10 ～23”DNAzyme为模板设计了特异性切割人鼻病毒14(humanrhinovirus14)5’端非编码区的 DNAzyme，通过应用3’－3’反相T连接、2’－O－甲基化RNA和锁核酸、调整识别臂的臂长等措施对其进行优化，大大增强了其催化活性和抵抗核酸酶降解的稳定性，当切割RNA的不同靶点时，只需对其进行轻微修饰即可，这为DNAzyme最终应用于病毒感染的临床治疗奠定了基础;Takahashi等则以“10～23”DNAzyme为模板，设计了可特异性切割A型流感病毒PB2 mRNA翻译起始区的PB2Dz，并在COS细胞中观察其抑制效果好于反义核酸。此外还有人设计了切割人乳头瘤病E6/E7转录物的DNAzyme等。

3．4 其他领域的应用 除了用于病毒学研究外，脱氧核酶还被用于细胞信号转导、肿瘤的治疗、心血管疾病的基因治疗。其研究领域也从最初的细胞外体系水平到细胞水平和动物水平，并取得了较为满意的效果。

4 DNAzyme的优缺点

DNAzyme种类很多，既可以针对RNA，也可以切割或修饰DNA。病毒的基因组较简单，加之病毒生存周期活细胞依赖的特殊性，使病毒对于核酸损伤特别敏感，同时也使DNAzyme在病毒感染性疾病的治疗和诊断中的应用具有很好的可操作性和可行性。由于RNA核酶片段较大，结构复杂，对靶位点的接近性差，并且合成十分困难，极易降解，使其应用受到限制。而DNAzyme的高效性、高特异性、高稳定性、短小精悍、易修饰、廉价低毒等特性使其作为一种新型的基因抑制工具，在多种领域的基因治疗中得到了广泛应用，许多针对病毒感染性疾病设计的DNAzyme已经进入临床实验评估阶段。随着各种研究数据的积累和新型高效传送载体的开发，DNAzyme必将在病毒学研究及病毒性疾病的治疗、酶学研究、生命进化研究、分子生物学、分子遗传学和医药生物技术等领域发挥更大的作用。

但是DNAzyme的应用也存在许多不利因素，如RNA非正确折叠，表达核酶浓度偏低，亚细胞空间隔离以及RNA不稳定性限制了DNAzyme的潜力发挥［20－21］。同时脱氧核酶还受很多因素的影响。如:pH值，二价金属阳离子，缓冲液的种类，温度，底物的结构，底物结合区的长度和碱基结构，化学修饰和调节物。

因此，目前实验室中用体外分子进化技术设计合成的脱氧核酶，一般遵循以下基本原则:①剪切位点应符合脱氧核酶对靶位的要求［2，11］;②设计的脱氧核酶不应形成自身分子内Walson－Crick碱基配对;③注意避开底物RNA中过长分子内碱基配对区和特殊高级结构区［2，11，22］;④应使底物结合区的长度和碱基构成之间达到最优化［22－23］。对于细胞和动物水平试验，还必须注意如下问题:①能在生理条件(包括离子浓度和pH等)下发挥剪切活性;②靶位必须位于RNA的重要功能区。如果要使所设计的脱氧核酶对某种病原体的每一变异株均有良好的剪切作用，则有碱基变异的靶序列不应入选;③应能抵御核酸酶的降解，需要对核酸酶进行必要的化学修饰［24－26］;④应被细胞有效摄取，有良好的亚细胞定位性，具有良好的药物代谢动力学［11］;⑤细胞毒性或其他毒副作用很少或无，不会误切宿主正常的 mRNA［11，22－23］。

5 展望

目前对于DNAzyme的结构和功能已有初步了解，但多数研究仍处于试验阶段。科学家还必须继续寻找新的催化效率更高的DNAzyme，进一步了解其结构和功能特点。试验证明一种新型的DNAzyme(ASON－Bulge－DNAzyme)在基因沉默表达中比“10～23”型 DNAzyme更有效更稳定［27］。这种新型的DNAzyme具有更高的切割效率和稳定性，课题组将进一步开展其在PRRS病毒、新城疫病毒及圆环病毒中的作用。但要使脱氧核酶真正用于人类疾病的防治，仍有很长的路要走。诸如脱氧核酶如何导入细胞与表达;脱氧核酶引入细胞后的稳定性;脱氧核酶结构的设计，特别是选择合适长度的侧翼;底物的选择以及如何提高脱氧核酶的活性等方面均有待于进一步探索和解决。

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