大孔吸附树脂富集纯化川贝母总生物碱的工艺研究

张剑光，张志锋,吕露阳，何丽华

(1.西南民族大学少数民族药物研究所，成都，四川 610041,2.湖南师范大学医学院，长沙，湖南 410013)

贝母为百合科（Liliaceae）贝母属植物，其味苦、性寒，具有清热润肺、化痰止咳、抗肿瘤、降血脂、平喘、神经中枢保护[1-4]等功效，用于治疗哮喘、支气管炎、淋巴结核、干咳少痰，阴虚劳嗽等。川贝母在我国主要分布于四川、西藏、云南等海拔在3200～4200米的高原地区[5]，主要药效成分是西贝素、贝母甲素、贝母乙素、川贝酮等[6]总生物碱。传统生物碱提取、分离、纯化主要是采用非极性的有机溶剂来萃取，该方法缺点是分离不彻底，成本高，污染环境等。大孔吸附树脂技术由于具有吸附快，解吸率高，吸附容量大，洗脱率高，树脂再生简便等优点，近年来被广泛用于中草药成分的研究[7]，本实验旨在优选出一种适合纯化川贝母总生物碱的大孔树脂，以总生物碱的含量为考察指标，筛选分离纯化川贝母总生物碱的最佳工艺条件，为川贝母总生物碱的开发利用提供科学的依据。

1 仪器与材料

TU-1901双光束紫外可见分光光度计 （北京普析）；METTLER AE240电子分析天平 （梅特勒-托利多）；PHS-3型酸度计（北京华瑞）。贝母乙素对照品（中国药品生物制品检定所 批号：110751-200709）； 大孔树脂： D-101、HPD-100、HPD-300、HPD-722（沧州宝恩），SA-2、AB-8(天津欧瑞)，H-103（上海华羚）；溴甲酚绿（天津大茂）；无水乙醇、氯仿、浓氨水（成都）等均为分析纯。川贝母药材于2010年6月采自四川省康定县新都桥，人工种植，由四川大学华西药学院张浩教授鉴定为卷叶贝母(Fritillaria cirrhosa D.Don)。

2 方法与结果

2.1 样品制备

2.1.1 供试样的制备

取5g贝母药材粉末 （过60目），置于250mL圆底烧瓶中，加入2倍体积（10mL）的浓氨水浸泡2h，然后加入 30倍体积（150mL）氯仿-甲醇（v/v=4:1）混合试剂在70℃水浴中回流4h，过滤，用混合试剂洗涤3次，浓缩成浸膏，用2%盐酸定容到5mL容量瓶中，得1g生药/mL贝母供试样溶液,其他浓度根据浓度需要调整。

2.1.2 标准品溶液的制备

精密称取已烘干至恒重的贝母乙素对照品2.0 mg置于10 mL容量瓶，用氯仿溶解并定容至刻度线，摇匀，得贝母乙素对照品溶液0.20 mg/mL.

2.2 总生物碱含量的测定[8]

2.2.1 标准曲线的制备

取对照品溶液 0.4，0.6，0.8,1.0,1.2mL，1.5mL置于25mL容量瓶中，分别加入5mL pH=5的缓冲液，2mL 0.05%的溴甲酚绿溶液，用氯仿定容至刻度线，摇匀并激烈振荡后转移至125mL分液漏斗中，静置分层20min，分离出氯仿层。空白不加对照品外，其他试剂均加。用紫外分光光度计，在波长为415nm处测量其吸光度。回归线方程为：A=2.9391X-0.0033 （R2=0.9967）贝母乙素浓度在0.08-0.3mg内有很好的线性关系。

2.2.2 贝母总生物碱的含量测定

取适量供试样品溶液，用5%氢氧化钠调节碱性，置于分液漏斗中，用氯仿萃取3次，每次20mL,合并萃取液，挥干，用氯仿溶解并定容到25mL容量瓶中，精确取2.0 mL置于25mL容量瓶中，按照"2.2.1"项步骤，从"分别加入5mL pH=5的缓冲液"起，测量其吸光值，计算总生物碱的含量。

2.3 大孔树脂的筛选

称取预处理好的7种大孔树脂，每份相当于干树脂1g，置于100 mL的三角瓶中，分别精确加入pH值为11.6、0.117g生药/mL药液30mL，振摇24h，取适量上层清液置于分液漏斗中，按照"2.2.2"项步骤，从"置于分液漏斗中，用氯仿萃取3次"起，测量上清液中总生物碱的含量，计算各种大孔树脂的吸附量。将上述充分吸附后的树脂，过滤，擦干大孔树脂表面的水珠，将其置于250mL的三角瓶中，分别精确加入40mL 95%乙醇，振荡24h，过滤，取上清液适量，挥干，用氯仿溶解并定容与25mL容量瓶中，按照"2.2.1"项步骤，从"分别加入5mL pH=5的缓冲液"测量洗脱液中总生物碱的含量。计算各种树脂的吸附容量、解吸量、解吸率。。由表1结果，可见HPD-100树脂有较好的吸附能力和解吸能力，其洗脱率高达94.7%。故选择HPD-100树脂来富集纯化川贝母的总生物碱。

表1 不同类型大孔吸附树脂静态吸附及解吸性能树脂类型

2.4 大孔树脂动态吸附生物碱的影响因素考察

2.4.1 药液pH值对大孔树脂吸附效果的影响

取已处理好的HPD-100树脂5份（每份相当干树脂3g），精确吸取浓度0.117g生药/mL、pH值分别为 6.5、9.3、11.6、12.6、13.5 的上样液各 30mL，以2BV/h考察不同pH值药液对树脂吸附影响，计算比吸附量，比吸附量=总生物碱质量/干树脂质量。表2的实验结果表明，生物碱在弱酸性条件下处于复盐状态，不利于大孔树脂对生物碱的吸附纯化，在碱性条件处于游离状态，有利于大孔树脂对生物碱的吸附纯化，当pH值为11.6时，吸附效果最佳。

表2 pH值对吸附效果的影响

2.4.2 上样药液浓度对大孔树脂吸附的影响效果

取已处理好的HPD-100大孔树脂6份（每份相当干树脂3g），上样液的pH值为11.6，吸取浓度分别为 0.117、0.175、0.235、0.29、0.376g、0.428g 生药/mL的上样液各30mL,考察不同上样液浓度对大孔树脂吸附效果的影响，并计算比吸附量。从表3可知，上样药液浓度过高或者过低都不利于总生物碱的吸附，最佳上样药液浓度为0.293g生药/mL。

表3 药液浓度对吸附效果的影响

2.5 大孔树脂的最大吸附量的考察

取已处理好的HPD-100大孔树脂 （相当干树脂 5g），取 0.293g生药/mL、pH=11.6的上样液250mL，以每10mL收集一份过柱流出液，测量每份流出液的药液总生物碱的含量，绘制总生物碱的动态吸收泄露曲线。图1表明，HPD-100大孔树脂在70mL质量浓度为0.293g生药/mL川贝母药液而未见泄露，即1g HPD-100树脂可以吸附14mL，相当于4.1g生药。

图1 HPD-100大孔吸附树脂对总生物碱的动态吸附曲线

2.6 洗脱媒介的考察

取已处理好的HPD-100大孔树脂1份 （相当干树脂3g），按照上述研究得到最佳吸附工艺条件精密加入上样液30mL，先用4BV蒸馏水除去表面杂质，依次用 20%，40%，60%，80%,95%乙醇各4BV，洗脱速度为2BV/h，考察不同乙醇浓度洗脱能力，计算解吸率。图2表明，80%乙醇洗脱所得到的总生物碱质量最多，因此选择80%乙醇洗脱。

图2 不同乙醇浓度对总生物碱的洗脱效果的影响

2.7 洗脱剂体积流速的考察

取已处理好的大孔树脂4份 （每份相当干树脂3g），加入上样液30mL，先用4BV的蒸馏水洗去表面的杂质，各用4BV 80%的乙醇以1BV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h的体积流量洗脱大孔树脂，收集洗脱液，考察不同体积流量对大孔树脂洗脱的影响。图4表明，洗脱速度慢，洗脱效果好。1BV/h和2BV/h的洗脱效果相差不明显，考虑到生产效率，故选择2BV/h为洗脱速度。

图3 洗脱剂体积流量与总生物碱量的关系

2.8 洗脱剂用量的考察

取已处理好的HPD-100大孔树脂1份 （相当干树脂3g），湿法装柱，加入药液30mL，充分吸附后，用先用4BV的蒸馏水洗去表面的杂质，再以2BV/h的80%的乙醇洗脱大树脂，每1BV收集一份洗脱液，考察洗脱剂最大用量。图5表明，80%的乙醇洗脱6BV后，洗脱率达98.3%，考虑到洗脱剂的效率和成本，故选择洗脱剂用量为6BV。

图4 动态解吸曲线

2.9 验证试验

吸取浓度为0.293g生药/mL川贝母药液30mL（理论总生物碱量28.3mg），按照上述研究得到最佳吸附工艺条件上柱洗脱，用水洗脱后，收集80%乙醇洗脱液，将洗脱液减压蒸干，制备干浸膏，称重,计算总生物碱纯度及收率。采用同样的方法平行三次，结果如表4，HPD-100大孔吸附对贝母总生物碱的纯化工艺稳定，重现性好,纯化后贝母从生物碱达到51.92%，收率达到76.65%。

表4 工艺重复实验（n=3）

3 讨论

本实验通过考察不同型号大孔吸附树脂的静态和动态吸附解吸实验，对其吸附与解吸性能进行研究，结果表明HPD-100型大孔吸附树脂富集纯化贝母总生物碱的工艺条件简单易行，具有吸附快、稳定、有效成分损失少等优点，而且川贝母提取液在经过大孔树脂纯化后，大部分的杂质都被除去，对川贝母有效成分能有很有效的进行富集，使其质量分数明显增加。因此本工艺在富集和分离贝母总生物碱中具有一定的应用价值，从而为进一步开发利用贝母有效成分提供科学依据，并且可以为贝母总生物碱的大规模纯化生产提供参考。

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