小檗碱对早期ACM大鼠治疗效果及机制的研究

杨 慧，朱俐俐

（湖南师范大学医学院第二附属医院，中国人民解放军第163医院综合内科，湖南 长沙 430003）

酒精性心肌病 （Alcoholic Cardiomyopathy，ACM）是由慢性过量饮酒或间断酗酒导致的一种非缺血性的扩张性心肌病，临床上以心脏扩大、心律失常、心功能下降为主要特征，关于ACM的发病机制尚不明确，临床上也无特异性药物治疗，主要以戒酒，辅以大量维生素B、C及对心功能下降予以相关药物对症支持治疗。小檗碱(berberine，BBR)是从黄连和黄柏等中草药中提取的生物碱，已有大量研究发现BBR有多种心血管药理作用，如：BBR具有直接增强心肌收缩力、扩张外周阻力血管、抑制心室重构及改善心功能的作用[1]，其疗效和安全性均得到普遍认可，但相关的作用机制和适用范围还有待进一步研究。本研究建立早期ACM大鼠模型，观察BBR对早期ACM大鼠心脏结构与功能及心肌组织中MMP-2/TIMP-2的影响，初步探讨其作用机制，为该药在其他领域的应用提供进一步的实验研究，为临床治疗研究ACM寻找新思路提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及实验条件

成年雄性SD大鼠SPF级50只，体重250～300g，购自中南大学动物实验学部，动物生产许可证号：SYXK（湘）2007-0037。动物饲养于中南大学动物学部清洁级动物房，12 h光照和黑夜循环，温度22℃±2℃，湿度50%-60%，标准基础饲料。

1.2 早期酒精性心肌病大鼠模型建立及分组

按照参考文献[2]闫军等人的建模方法，采用随机数字表法随机抽取SD大鼠10只作为正常对照组，其余 30只作为ACM造模组，用56%白酒（红星二锅头酒，北京红星股份有限公司，批号：20070807，酒精度：56%）灌胃，第1周每天给酒5 mL/kg，1次灌胃，同时给予10%的乙醇随意饮用；第2周每天给酒10 ml/kg，分2次灌胃，同时给予10%的乙醇随意饮用；第3周每天给酒10 ml/kg，分2次灌胃，同时给予20%的乙醇随意饮用；第4周每天给酒15 mL/kg，分3次灌胃，同时给予20%乙醇随意饮用，至第16周，采用超声心动图对全部存活大鼠检测诊断，以左心扩大、左室舒张功能减低为判断早期ACM建模成功的标准。将建模成功的28只SD大鼠随机分为小檗碱治疗组、安慰剂对照组，并随机抽取10只正常SD大鼠作为正常对照组。

1.3 给药方法

小檗碱治疗组予以小檗碱20 mg/kg/d（东北制药总厂，批号:20090518)，灌胃4周，此处参照参考文献[3]，安慰剂对照组和正常对照组予以等量蒸馏水灌胃4周。

1.3 超声心动图检测

称取体重，以10%水合氯醛按0.3mL/100g腹腔注射麻醉大鼠，待到其没自主活动且保持自主呼吸的情况下，剃除其左胸前区鼠毛，仰卧位将其固定，连接11导心电图，应用彩色多普勒超声诊断仪(美国GE公司Vivid 7)，探头频率为 8MHz，双盲法专人操作仪器。采用标准的胸骨旁左室长短轴、心尖四腔切面，观察心脏结构，于胸骨旁左室长轴切面，腱索水平用M-型超声测量心脏结构及功能参数：左室收缩末期内径（left ventricular end-systolic dimension,LVESD）、左室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic dimension,LVEDD）、左房收缩末期内径（left atrium,LA）、射血分数（ejection fraction,EF）、短轴缩短率（fractional shortening,FS）；心尖四腔切面使用组织多普勒成像 （tissue doppler imaging,TDI）测量测定二尖瓣内环舒张早期、晚期运动速度之比值（Em/Am），图像数据存盘，以便分析。所有测值均取3次心动周期测量的平均值。

1.4 PT-PCR检测心肌组织MMP-2mRNA、TIMP-2mRNA的表达

处死大鼠后，剪取50～80mg大鼠心脏组织放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，按步骤加入各试剂，提取各组心肌组织总RNA。所用引物、退火温度、扩增片段长度及扩增条件如下：MMP-2 sense 5'-AGA CCG CCA TGT CCA CTG-3'antisense 5'-TTG TCG CAC ACC ACA TCT-3'扩增片段为299 bp， 退 火 温 度 55℃ ；TIMP-2 sense 5'-CCAAAGCAGTGAGCGAGAA -3 antisense 5'-CATCCAGAGGCACTCATCC-3'扩增片段为 386 bp，退火温度 57℃。扩增条件为：预变性95℃、5分钟，进入循环，94℃、1分钟，退火 1分钟，72℃、1分钟，30个循环后，72℃终末延伸8分钟。将PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，置于凝胶图像分析系统进行吸光度扫描，与GAPDH mRNA的比值计算目的基因mRNA的相对含量。

1.5 心脏组织标本切片HE染色

处死大鼠，取其心脏中段，10%甲醛溶液固定，作常规石蜡切片，进行HE染色，观察心脏病理学变化。

1.6 统计学分析

所得数据均用mean±SD表示，多个样本均数间的比较采用单因素方差分析，两组间的比较采用t检验，均数之间两两比较采用q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

建模过程中，1只大鼠死于胃扩张致死，1只死于胃出血。成功建模28只，随机分为小檗碱组和安慰剂对照组，每组14只。建模成功后大鼠少食少动，排不成形稀便，小便多，毛色枯黄，无光泽，体态呆板、行动迟缓、反应迟钝、嗜睡，易激惹，体重增长缓慢。后期实验过程中无大鼠死亡，正常对照组大鼠食欲和大小便正常，毛发光亮，动作灵活，体重增长稳定；安慰剂对照组少食少动，大便稀，小便多，毛色发暗，倒毛，无光泽，嗜睡，易激惹，体重增长较正常对照组缓慢；小檗碱治疗组大鼠食欲和大小便逐渐恢复正常，毛发有光泽，动作协调，体重稳定增长。

2.2 小檗碱对各组大鼠心脏结构与心功能参数的影响

各组大鼠心脏结构与心功能参数见表1。

表1 各组大鼠心肌结构与心功能参数的比较

2.3 MMP-2/TIMP-2在早期ACM大鼠心肌组织中的表达及小檗碱对其的影响

各组MMP-2/TIMP-2mRNA的表达情况见表2。其中小檗碱治疗组心肌组织MMP-2mRNA表达显著下降，TIMP-2mRNA表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；提示小檗碱具有一定降低ACM大鼠心肌MMP-2表达，提高TIMP-2表达的作用（见图 1，2）。

表2 MMP-2/TIMP-2mRNA在各组大鼠心肌组织中的表达mean±SD

图1 MMP-2 mRNA在各组心肌中的表达

图2 TIMP-2 mRNA在各组心肌中的表达

2.4 病理切片结果

正常对照组显微镜下心肌细胞结构完整，细胞浆红润，细胞核完整，排列整齐，心肌纤维排列正常、无断裂，无细胞间质炎细胞浸润，血管壁结构正常、无破裂。安慰剂对照组显微镜下心肌细胞肥大，心肌纤维排列紊乱，心肌间质炎细胞浸润，血管壁结构正常。小檗碱治疗组显微镜下部分心肌细胞肥大，排列紊乱，心肌间质无炎性细胞浸润，血管壁结构正常、无破裂（见图3）。

图3 安慰剂对照组及小檗碱治疗组心脏病理切片（HE染色，x400）

3 讨论

ACM是由慢性过量饮酒引发的一种继发性心肌疾病，分为心脏扩大、舒张功能受损的早期无症状阶段和心室壁变薄、心脏继续扩大、心肌收缩功能下降的有症状阶段[4]，关于ACM发病机制尚不十分明确，目前关于ACM发病机制的研究多集中在酒精及其代谢产物对心肌细胞的直接毒性作用和氧化应激损伤心肌细胞等学说上，从细胞外基质（extracellular matrix，ECM）水平研究与探讨ACM发病机制的有关报道还较少。心肌组织中三分之二的细胞是非心肌细胞，即ECM，ECM对心肌细胞具有结构上的支持和保护作用，且具有细胞间信息传递、协调舒缩功能、维持心肌细胞及心肌纤维的排列、限制心肌细胞过度拉长的作用，生理情况下ECM处于不断产生和降解的动态平衡中[5]。MMP-2又称明胶酶A，是降解ECM锌结合蛋白基质金属蛋白酶家族中重要一员，TIMP-2是MMP-2的内源性特异性抑制剂，MMP-2与TIMP-2之间的平衡共同调节ECM的降解与合成，MMP-2的表达和活性过度增强或MMP-2/TIMP-2比例失调，可导致ECM广泛降解，使正常的心肌胶原蛋白过度降解，心肌间质纤维化，心室重构，引起心腔扩大、室壁变薄[6]，参与多种心血管疾病的发展过程，如：王鹏飞等人[7]研究发现在心肌梗死后损伤的心肌细胞刺激IL-1β的表达，引起梗死相关的炎症，改变MMP-2表达活性，使正常的胶原蛋白被升高的MMPs所降解，并被缺乏连接结构的纤维性间质所取代，促进心肌肥厚、心肌纤维化的心室重塑过程。关于ACM的治疗也无特异性药物，BBR作为抗肠道细菌感染类药物已有2500多年的历史，近年来研究发现BBR在调脂、降糖、改善胰岛素抵抗、抗心律失常、改善慢性心力衰竭患者心功能及逆转心室重构等方面疗效显著[3]。研究ACM的发病机制及寻求有效治疗ACM的药物具有重要意义。

机体摄入过量酒精导致活性氧自由基增多，并引发机体产生多种炎症介质及细胞因子，如IL-6、TNF-α、hs-CRP、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子等[8]，此类因素均可刺激MMPs的过度表达，已有实验证实[7]，在心室重构过程中，MMPs发挥了重要作用。本研究结果显示：与正常组比较，安慰剂对照组大鼠心脏扩大、左室舒张功能减低，心肌组织中MMP-2mRNA表达显著上调，TIMP-2mRNA的表达显著下调，与上述结果一致，提示MMP-2/TIMP-2之间表达失衡参与ACM病理过程，两者作用于ACM心肌ECM的代谢过程，使正常的胶原被降解并被缺乏连接结构的纤维性结构所取代，从而使心肌纤维化、室壁变薄，临床表现为心脏扩大、心律失常以及心功能下降。

朱小凤等人[9]研究发现BBR通过降低心肌梗死左室充盈压，减轻左室前负荷，提高心肌收缩力，从而改善心肌梗死后受损的心功能。研究同时发现BBR具有降低左心室质量指数，改善左心室重构的作用。本实验显示：小檗碱组LVEDD、LVESD、LA减小，左室舒张功能有所改善，心肌组织中的MMP-2 mRNA表达水平显著下降，TIMP-2 mRNA表达显著升高(P<0.05)。证实BBR能够抑制心肌组织MMP-2表达，改善左室舒张功能及减小房室大小，与以上研究结果一致。提示BBR通过抑制心肌细胞MMP-2的表达，抑制心肌ECM降解，防止心肌胶原蛋白过度降解，心肌纤维化，进而影响心室重构的发生发展，最终实现对早期ACM心肌组织的保护作用，改善ACM导致的房室扩大、室壁变薄、心功能下降。

综上所述，我们认为MMP-2/TIMP-2的失衡导致的ECM异常降解，心肌胶原代谢失衡、心肌纤维化可能是ACM的发病机制之一。BBR可能通过抑制MMP-2的过度表达，调节心肌组织中MMP-2与TIMP-2之间的平衡，抑制心室重构从而发挥其心肌保护作用。本次实验为研究ACM的发病机制及治疗提供了新思路，由于各方面的限制，本次实验是针对大鼠早期ACM对小檗碱治疗作用进行观察，未对大鼠有症状期ACM进行干预研究，且未对BBR保护早期ACM心肌组织的分子生物学机制进行深入研究，以上均需进一步的实验研究和探讨。

[1]Xuan Xia,Jinhua Yan,Yunfeng Shen,et.Berberine Improves Glucose Metabolism in Diabetic Rats by Inhibition of Hepatic Gluconeogenesis[J]Plos One,2011,6(2):e16556.

[2]闫军，郑敏，朱芳芳，等.超声心动图评价早期ACM大鼠心肌结构和功能的研究.医学影像学杂志[J]，2010,20(7):1057-1059.

[3]Xiao HB,Sun ZL,Zhang HB,et.Berberine inhibits dyslipidemia in C57BL/6 mice with lipopolysaccharide induced inflammation.Pharmacol Rep[J].2012,64(4):889-95.

[4]Yuan L,Lu LX,Zhang QH,et.Roles of PYK2 and caveolin-1 in alcoholic cardiomyopathy and the effect of drug intervention.Zhonghua Yi Xue Za Zhi[J].2011,91(22):1561-5.

[5]Ali MA,Fan X,Schulz R.Cardiac sarcomeric proteins:novel intracellular targets of matrix metalloproteinase-2 in heart disease[J].Trends Cardiovasc Med[J].2011,21(4):112-8.

[6]Ajay Kumar Chaudhary,Mamta Singh,Alok C Bharti.Genetic polymorphisms of matrix metalloproteinases and their inhibitors in potentially malignant and malignant lesions of the head and neck[J].J Biomed Sci,2010,17(1):1186-1423.

[7]王鹏飞，刘振，刘玲玲，等.左室重构中IL-1β和MMP-2、MMP-9/TIMP-1的内在联系及作用机制.Chinese Journal of MedicinaI Guide[J].2010,12(9):1588-1590.

[8]Soufen HN,Salemi VM,Aneas IM,et.Collagen content,but not the ratios of collagen type III/I mRNAs,differs among hypertensive,alcoholic,and idiopathic dilated cardiomyopathy[J].Braz J Med Biol Res.2008,41(12):1098-1104.

[9]朱小凤，刘志忠，徐兢.抑制心肌梗死后心室重构的作用.中国介入心脏病学杂志[J].2009,17（6）：335-337.