维生素E对LPS诱导的急性肺损伤中氧化应激的影响

张天杰，李雪飞

（湘南学院基础医学部，湖南 郴州 423000）

急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是指由严重感染、创伤等病因所致的肺泡毛细血管内皮细胞、肺泡上皮细胞和肺间质的弥漫性损害[1-2]。氧化应激是指体内氧化与抗氧化作用失衡，导致炎性细胞浸润、蛋白酶分泌增加及多种细胞因子的释放，而其介导的组织损伤是ALI的重要发病机制[3]。研究表明抗氧化剂能降低毛细血管的通透性、增加抵抗感染的能力。维生素E是一种脂溶性维生素，可作为一种保护细胞膜的抗氧化剂，其能通过捕获参与过氧化链反应的氧自由基或者脂质过氧自由基而发挥抑制脂质过氧化的效应[4]。有关维生素E对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的ALI时肺组织中氧化应激的影响尚未见报道，本研究旨在通过观察维生素E对LPS诱导的ALI中氧自由基的影响，为ALI的临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

Wistar大鼠购自中南大学实验动物部，逆转录试剂盒和PCRmix购自美国Fermentas公司；Trizol购自美国Invitrogen公司；MDA、LDH、SOD检测试剂盒购自南京建成；TNF-α ELISA试剂盒购自上海生工；维生素E购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组

以Wistar大鼠为研究对象，共45只，随机分为3组 （正常对照组、ALI组和经维生素E预处理的ALI组），每组15只。ALI组每天经腹腔注射生理盐水 2ml，14 d 后于腹腔注射 LPS（10 mg/kg）；维生素E预处理组每天于腹腔注射维生素E（100 mg/kg），14 d后再腹腔注射LPS（10 mg/kg）；正常对照组每天经腹腔注射等体积的生理盐水。ALI组和维生素E预处理组注射LPS 6 h后，将各组大鼠处死。

1.2.2 Wistar大鼠肺组织中MDA的含量及LDH、SOD活性的检测

处死Wistar大鼠后立即取肺，并用生理盐水清洗肺组织表面的血渍，准确称取组织重量，按重量体积比为1:9加预冷PBS制备成10%的组织匀浆，1500 g离心10 min取上清液，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，按照说明书检测匀浆上清液中MDA的含量及LDH、SOD活性。

1.2.3 RT-PCR检测Wistar大鼠肺组织中TNF-α mRNA的表达

Wistar大鼠肺组织采用液氮研磨后加Trizol，并按Trizol试剂盒说明书提取总RNA；按试剂盒说明进行总RNA逆转录，产物保存于-20℃；GAPDH引物序列：上游：5'-aagcccatcaccatcttcca-3',下游：5'-cctgcttcaccaccttcttg-3'，扩增片段 580 bp；TNF-α 引物序列：上游：5'-gccaccacgctcttctgtc-3'，下游：5'-gctacgggcttgtcactcg-3'，扩增片段 348 bp。 PCR反应条件为：95℃ 3min 预变性，95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1min,28个循环后72℃ 5 min。反应体系为50?L：2×PCR mix 25?L，10 pmol/L 上、下游引物各2?L，DEPC水17?L，模板4?L。PCR扩增产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳，拍照后利用 Quantity One软件测定灰度值，以光密度代表其表达量，并计算目的基因的相对表达量。

1.2.4 ELISA检测Wistar大鼠肺组织中TNF-α蛋白的水平

取大鼠肺组织匀浆上清液，离心，收集上清液。标准孔各加不同浓度的标准品50 μL；样本孔先加待测样本 10 μL，再加样本稀释液 40 μL；除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测兔抗鼠抗体100 μL，封板，37℃ 孵育60 min，弃液；每孔加洗涤液，静置 1 min，弃液，如此重复洗板5次；每孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min；每孔加入终止液50 μl，450 nm波长处测定各孔的OD值；以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

1.3 统计学分析

所有样本用SPSS 16.0进行统计学分析，数据采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 维生素E对LPS诱导的ALI大鼠肺组织MDA含量、LDH及SOD活性的影响

LPS作用于大鼠6 h后检测各组大鼠肺组织中MDA含量、LDH及SOD活性，结果显示ALI组与正常对照组比较MDA的含量升高、SOD活性下降、LDH的活性增强（P＜0.05）；维生素E预处理组与ALI组比较MDA的含量降低、SOD活性增强，LDH 的活性减弱（P＜0.05）（表 1）。

表1 各组大鼠肺组织MDA含量、LDH及SOD活性比较

2.2 维生素E对LPS诱导的ALI大鼠肺组织TNF-α mRNA表达的影响

LPS作用于大鼠6 h后，用RT-PCR检测各组大鼠肺组织中TNF-α mRNA的表达，结果表明，与正常对照组比较，ALI组TNF-α mRNA表达明显增加（P<0.05），而维生素 E处理组 TNF-α mRNA表达低于 ALI组（P<0.05）（图 1）。

图1 各组大鼠肺组织TNF-α mRNA表达

2.3 维生素E对LPS诱导的ALI大鼠肺组织TNF-α蛋白表达的影响

LPS作用于大鼠6 h后，用ELISA检测各组大鼠肺组织中TNF-α蛋白的表达，结果显示，与正常对照组比较，ALI组TNF-α蛋白含量明显增加（P<0.01）；维生素E处理组TNF-α蛋白含量与ALI组比较，明显降低（P<0.01）（图 2）。

图2 各组大鼠肺组织TNF-α蛋白表达

3 讨论

ALI是由多种病因引起的肺形态学病理改变和急性肺功能损害，引起肺损伤的介质包括炎症细胞因子、氧自由基以及前列腺素类代谢产物等，是临床上导致急性呼吸衰竭的常见病因之一[5-6]。尽管有关ALI发病机制的研究取得了诸多进展，但近30年来ALI的死亡率仍然高居不下，如美国每年ALI住院患者的死亡率为38.5%。因此，深入研究ALI的发病机制，寻找新的诊治策略迫在眉睫。

氧化应激介导的组织损伤是ALI的重要机制之一。人体内存在着氧化系统和抗氧化系统，氧化系统主要是体内产生的自由基，而抗氧化系统包括一些抗氧化酶和抗氧化物。人体内总自由基中约95%以上属于氧自由基，具有较强的氧化能力。人体新陈代谢会持续不断的产生氧自由基，呼吸道和肺组织承担着机体所需氧气的供给和交换，肺组织极容易受到氧自由基的攻击，但通常情况下肺组织并没有受到损伤，这是由于血液和肺组织存在着严密的抗氧化系统，如维生素E、维生素C、SOD及谷胱甘肽等，使氧自由基的产生与清除保持动态平衡[7]。当氧自由基的产生过多时，一方面氧自由基直接损伤细胞膜中不饱和脂肪酸，使脂肪酸链断裂，导致膜的流动性减低而通透性增加。另外还使更多的氧自由基被释放到肺组织，直接损伤肺泡上皮及肺血管内皮细胞，导致肺泡上皮细胞变性坏死，肺毛细血管壁通透性增强，血浆及纤维蛋白从毛细血管渗到肺泡，引发并加重肺水肿，促成了ALI的发生[8]。大量的氧自由基还增加花生四烯酸代谢产物如血栓素、前列腺素E、白三烯C4等的释放，参与炎症过程。

SOD的主要生理作用是歧化氧自由基，及时清除机体生成的氧自由基，切断自由基链锁反应，防止自由基对组织细胞产生毒害作用，从而保护细胞免受氧自由基的攻击，因此SOD活力高低可间接反映组织清除氧自由基的能力[9]。氧自由基还可攻击生物膜中的不饱和脂肪酸，使其发生氧化，引起脂质过氧化产物MDA升高，而脂质过氧化是造成生物体氧化损伤的主要原因，因而通过测定体内MDA含量，可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映体内自由基对细胞的损伤程度[10]。LDH是一种存在于机体所有组织细胞的胞质内的一种稳定的酶，总LDH的释放一般都伴随着细胞损伤，在介质和肺中测量酶的活性可以评估细胞的损伤和生存，LDH是确定肺组织样本中肺上皮细胞损伤的首选测试[11]。因此本实验采用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法测定SOD、LDH活力及MDA的含量，以较全面地反映ALI时氧化损伤程度。本实验观察到LPS作用于大鼠后出现SOD活性下降，MDA的含量升高，提示LPS通过激发大鼠的氧化应激反应引起肺损伤。

维生素E又称α-生育酚，在体内与SOD、GSH共同构成抗氧化系统，其抗氧化作用主要是与脂氧自由基或脂过氧自由基反应，向它们提供氢离子，使脂质过氧化链式反应中断[12]，从而阻止自由基反应的进行，保护细胞膜磷脂和血浆脂蛋白中的多不饱和脂肪酸免受氧自由基的攻击。因此维生素E能保证细胞膜结构和功能的完整性，也可以缓解氧自由基造成的应激[13]。有研究证实维生素E能与活泼的自由基反应，将脂质过氧化物转化为羟脂，羟脂是一种较强的自由基清除剂；另一方面维生素E能抑制氧化酶系，激活和保护抗氧化酶系[14]。有研究表明[15]维生素E可降低机体的氧化应激水平并对慢性疾病有一定的预防作用，但维生素E对急性疾病如ALI中的氧化应激是否有影响，尚未见报道。本研究结果显示，维生素E预处理组可增强SOD活性，减弱LDH的活性，并降低MDA的含量，说明维生素E预处理可减轻LPS诱导的ALI大鼠肺组织的脂质过氧化损伤，发挥抗损伤效应。

在ALI的氧化应激过程中，多种炎症细胞如巨噬细胞被激活，巨噬细胞可通过分泌促炎因子如TNF-α进一步加重氧化损伤[16]。TNF-α诱导中性粒细胞，增加粘附分子的表达，最后导致呼吸爆发，致使氧自由基增加[17]。本实验表明维生素E预处理可减少LPS诱导的ALI大鼠肺组织的TNF-αmRNA及蛋白的表达，提示维生素E可降低氧化应激，从而减少炎症因子的表达，有利于氧化损伤启动的切断。

综上所述，氧化与抗氧化失衡、促炎和抗炎因子的失衡在ALI发病早期发挥着关键的作用，从理论上讲补充外源性的抗损伤物质启动内源性细胞保护机制，重建机体内氧化与抗氧化平衡，有利于肺损伤的修复。本研究证实，维生素E在LPS诱导的肺损伤中可明显减轻氧化应激反应，并减少TNF-α的释放，提示维生素E在切断LPS诱导的ALI的启动中可能具有重要作用，但其在ALI中的作用机制有待进一步研究。

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