8-溴-7-甲氧基白杨素通过上调Bim诱导肺癌A549细胞凋亡

龙灵芝,曹晓诚,周 蓓,肖立红,周 源

(湖南师范大学医学院,湖南 长沙 410013)

白杨素 (5,7-二羟基黄酮,5,7-dihydroxyflavone,chrysin)是一种广泛存在于多种植物、蜂胶和蜂蜜中的黄酮类化合物，在蜂胶中的含量高[1]，它具有多种药理活性，如抗炎症作用，抗氧化作用和抗癌作用[2]。已有研究表明，白杨素衍生物8-溴-7-甲氧基白杨素（8-bromo-7-methoxychrysin,BrMC）对肝癌细胞抑制增殖和诱导凋亡作用比先导化合物白杨素更强[3]。此外，也有报道称BrMC对胃癌SGC-7901 细胞[4]、白血病细胞[5]、人小细胞肺癌细胞[6]、有抑制和诱导凋亡作用。

在细胞凋亡的进程中，凋亡调节因子Bcl-2家族[7]起到非常重要的作用。Bim(Bcl-2 interacting mediator of cell death)是Bcl-2家族中只含有一个BH3结构域的蛋白，具有促凋亡活性。先前的研究证明：BrMC通过促进ROS生成和ROS依赖持续性JNK活化，诱导人HCC凋亡[3]。本文探讨BrMC诱导人非小细胞肺癌A549细胞凋亡与Bim表达的关联性。

1 材料与方法

1.1 试剂

BrMC黄色粉末由曹建国教授惠赠(MW347，纯度 98%)；非小细胞肺癌A549细胞系细胞购自上海中国科学院细胞所；PRMI-1640培养基 （Gibco公司）；胎牛血清（Hyclone 公司）；白杨素,碘化丙啶（PI）和 N-乙酰半胱氨酸(NAC，Sigma 公司)；兔抗人Bim多抗和小鼠抗人β-actin单抗及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体购自Biolegend公司；Hybond-ECL硝酸纤维素膜 （Amersham公司）；Lipofectamine2000脂质体 2000（invitrogen公司 ）；特 异 性 Bim smartpool， control smartpool（siRNA;SMARTpool,Dhar-macon,上海生工生物技术公司）。

1.2 细胞培养

肺癌A549细胞置37℃，5%CO2条件下，用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素的RPMI 1640培养基中培养。

1.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率

用无血清的RPMI 1640培养基将A549细胞培养 24 h，用 chrysin(10.0 μmol/L)或者不同浓度BrMC(5.0、10.0 μmol/L)作用于 A549 细胞 48 h 后，收集细胞，用PBS冲洗，4°C下乙醇固定24 h，PI染色，上流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.4 蛋白质印迹法

用浓度为10 μmol/L的BrMC分别处理A549细胞 0 h 、1h、3h、6 h和 12h， 离心收集。 100 μg的细胞总蛋白质和20 μg的膜蛋白经SDS-PAGE电泳，转膜后用5%脱脂奶/TBST（tris buffered saline with tween）封闭 2 h，加兔抗人 Bim 多抗（1：1000）4℃过夜。TBST洗3次，每次15 min，再加辣根过氧化酶标记的相应的二抗（1：50000）放置室温 2 h，用TBST洗3次，TBS 1次，每次15 min。用ECL系统检测，曝光20 s到5 min，显影2 min，定影5 min。将曝光的膜用TBS洗3次加小鼠抗人βtubulin 单抗（1：1000）或小鼠抗人单抗（1：1000），相应的二抗继续保温，用ECL系统检测。

1.5 小干扰RNA沉默Bim表达

将对数生长期的A549细胞接种于6孔及24孔细胞培养板中，接种时分别调整细胞密度为4×105和1×105/孔，用含10%胎牛血清无抗生素的RPMI 1640培养液培养，37℃，饱和温度下培养过夜。转染前用无血清的RPMI 1640培养液培养稀释特异性Bim siRNA、对照 siRNA及脂质体2000（Lipofectamine 2000），使 Bim siRNA 或对照 siRNA和脂质体2000的最终浓度分别为100 nm/L和120 nm/L。两者在室温混匀静置，期间把培养板中的培养液换成含5%胎牛血清无抗生素培养基，20 min后再把稀释好的Bim siRNA、和对照 siRNA加入相应的实验孔中，转染6 h换成含10%胎牛血清RPMI 1640继续培养。转染后24 h后分别用chrysin(10.0 μmol/L)或者不同浓度 BrMC(5.0、10.0 μmol/L)作用A549细胞至标示时间，收集细胞。上流式细胞仪检测。

1.6 NAC预处理对BrMC介导Bim的表达的影响

用10 mmol/L NAC预处理A549细胞系30分钟，再与1.0 μmol/L BrMC共同处理6 h。然后收集细胞，并制备全细胞蛋白的裂解物，用蛋白印迹分析法检测标示的蛋白。

1.7 统计学分析

用SPSS 15.0软件包建立数据库。数据表示为均值±标准差。用ANOVA分析，待方差异性检测后，两组均数之间的比较采用SNK法。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BrMC对人肺癌细胞A549细胞凋亡率的影响

PI染色流式细胞仪分析结果显示，与细胞对照组相比，白杨素和BrMC诱导A549细胞凋亡率增高，差异有统计学意义（P<0.05）。此外，BrMC较其先导化合物白杨素诱导A549细胞凋亡作用更强（表 1）。

表1 BrMC对肺癌A549细胞系细胞凋亡率的影响(Mean±SD,n=3)

2.2 BrMC对人肺癌A549细胞Bim蛋白表达的影响

用BrMC(10 μmol/L)分别作用A549细胞0 h、1h、3h、6 h和 12h后，采用 western blot检测 Bim蛋白表达的情况。图1可见Bim蛋白表达水平呈时间依赖性升高，开始于6 h，12 h达到峰值。

图1 .BrMC对肺癌A549细胞系细胞Bim蛋白表达的影响

用兔抗人Bim多克隆抗体进行Western blot分析BrMC（10 μmol/L）作用不同时间对A549细胞Bim蛋白的表达的影响，β-actin作为加样量对照。

2.3 小干扰RNA沉默Bim基因对A549细胞凋亡的影响

为了检定BrMC诱导Bim蛋白表达是否参与其促成A549细胞凋亡作用，我们用Bim特异性siRNA瞬时转染A549细胞，并以对照siRNA转染作为对照。PI染色流式细胞术分析结果证明：在对照siRNA转染A549细胞，BrMC有效诱导细胞凋亡；Bim特异性siRNA明显抑制BrMC诱导细胞凋亡，差异有统计学意义（P<0.05）。

图2 .流式细胞仪检测小干扰RNA沉默Bim基因对BrMC诱导A549细胞凋亡的影响

2.4 N-乙酰半胱氨酸预处理对BrMC介导Bim的表达的影响

我们用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC，10 mmol/L)预孵育A549细胞30min，然后，与BrMC(10.0 μmol/L)共同作用 24 h，Western blot分析 Bim蛋白表达。与对照组对比。BrMC单用上调Bim蛋白表达，NAC预孵育明显抑制BrMC介导Bim表达的上调(图 3)。

图3 .抗氧化剂NAC对BrMC介导Bim蛋白上调的影响

用兔抗人Bim多克隆抗体进行Western blot分析 NAC（10 mmol/L）预孵育对 BrMC（10 μmol/L）诱导A549细胞Bim蛋白的表达的影响，β-actin作为加样量对照。

3 讨论

肺癌在全球的发病率居高不下，5年存活率很低。寻求有效的治疗措施和药物，仍然是人们的迫切需求。Bim是近年来研究较多的一种促凋亡蛋白，Bim有 3种不同剪接形式，即：BimS、BimL和BimEL，其中编码蛋白分别含110、140和196个氨基酸。在人类基因组中，Bim基因位于2q12-q13[8]。目前，Bim在乳腺癌细胞，前列腺癌细胞，肺癌细胞[9]等多种细胞系凋亡调节的重要功能已经得到肯定。

Chrysin属于天然的具有生物活性的黄酮类化合物，BrMC是导师所在研究小组自主设计合成的类似物。本文的实验结果证明BrMC诱导A549细胞凋亡与其上调Bim蛋白表达有关。更为重要的发现是在siRNA沉默Bim基因后，BrMC诱导A549细胞的凋亡作用明显减弱。

虽然黄酮类化合物一般被认为是抗氧化剂，但是它们同样能依赖它们的结构和分子环境导致活性氧的产生[10]。活性氧在细胞内凋亡途径中发挥着重要作用。有研究表明白杨素类似物5,7-二羟基-8-硝基白杨素能通过活性氧生成和Akt磷酸化诱导细胞凋亡[11]。为了确定活性氧能否影响Bim的表达，在本文的研究中，我们用抗氧化剂NAC预孵育A549细胞，结果显示：NAC抑制BrMC介导Bim的表达上调，这些结果表明活性氧的产生是BrMC诱导Bim表达的上游事件。

总之，本文的研究结果揭示了BrMC通过促进活性氧生成上调Bim表达诱导肺癌A549细胞凋亡。然而，BrMC作为一种有效抗肺癌候选药物，还有待深入研究。

[1]Khoo BY,Chua SL,Balaram P.Apoptotic effects of chrysin in human cancer cell lines.Int J Mol Sci,2010,11(5):2188-2199.

[2]Cho H,Yun CW,Park WK,Kong JY,et al.Modulation of the activity of pro-inflammatory enzymes,COX-2 and iNOS,by chrysin derivatives.Pharmacol Res.2004;49:37-43,doi:10.1016/S1043-6618(03)00248-2

[3]Yang XH,Zheng X,Cao JG,8-Bromo-7-methoxychrysininduced apoptosis et al of hepatocellular carcinoma cells involves ROS and JNK.World J Gastroenterol,2010,16(27):3385-3393.

[4]向红琳,郑兴,曹建国.8-溴-7-甲氧基白杨素诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡 [J].中国药理学通报.2008,24(10):1370-1373.

[5]李凌，阳云，向红琳，曹建国.8-溴-7-甲氧基白杨素诱导白血病 Jurkat细胞凋亡[J].湖南师范大学学报(医学版).2010,7(4):7-21.

[6]安东健,邹敏，曹建国.8-溴-7-甲氧基白杨素对人小细胞肺癌细胞增殖和凋亡的影响 [J].临床肿瘤学杂志，2011,15：(1)16-20.

[7]边睿,佐佺,朱大海.Bim介导细胞凋亡的调控及临床意义[J].国际遗传学杂志,2006,29(5):379-382.

[8]Bouillet P,Zhang LC,Huang DC,et al.Gene structure alternative splicing,and chromosomal localization of proapoptotic Bcl-2 relative[J].Bim,Mamm Genome,2001,12:163-168

[9]宓伟,彭宪忠等.紫杉醇通过上调Bim表过诱导非小细胞肺癌凋亡[J].食品与药品,2008,10(9):12-14.

[10]Cao G,Sofic E,Prior RL.Antioxidant and prooxidant behavior of flavonoids:structure-activity relationships[J].Free Radic Biol Med,1997,22:749-760.

[11]Zhao XC,Tian L,Cao JG,Liu F.Induction of apoptosis by 5,7-dihydroxy-8-nitrochrysin in breast cancer cells:the role of reactive oxygen species and Akt[J].Int J Oncol,2010,37(5):1345-1352.