钩吻素子抗外周神经损伤致神经病理性疼痛中自发痛的效应

李苏平，许 盈，凌 倩，洪志红，刘 铭，杨 渐，俞昌喜

神经病理性疼痛（neuropathic pain，NPP）系慢性疼痛，其主要症状包括自发性疼痛（简称“自发痛”）、痛觉超敏和痛觉过敏，临床发生率分别为100%，64%和38%。3种疼痛症状中，自发痛发生率最高，被认为是反映患者疼痛“平均水平”和“最严重状态”的较理想的指标［1－2］。钩吻素子（Koumine，分子式C20H22N2O，相对分子质量306．3），属吲哚类生物碱（图1），是我国历史悠久的药用植物钩吻（GelsemiumelegansBenth．）的主要有效成分之一，具有抗慢性疼痛的作用［3］。为探讨钩吻素子对NPP中自发痛是否有效，本研究在外周神经损伤致NPP模型上，观察钩吻素子抗NPP中自发痛效应，为钩吻素子新药创制提供药效学的实验依据。

1 动物与方法

1．1 动物 雄性SD大鼠97只，体质量130～150g，清洁级［上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2007－0005］。实验前适应性饲养7d，光暗周期12／12h（光照时间8∶00～20∶00）下恒温（23±2）℃、恒湿度（50±5）%环境饲养，自由饮水饮食。所有针对大鼠的实验操作都遵守国际和本地实验动物使用和保护委员会颁布的条例。

图1 钩吻素子结构式Fig 1 Chemical structure of Koumine

1．2 方法

1．2．1 药品与试剂 钩吻素子粉末为本课题组分离纯化，纯度达99．1%。其余试剂均为国产分析纯。

1．2．2 大鼠坐骨神经慢性束缚损伤（chronic constriction injury，CCI）所致NPP模型的建立 参照文献［4］建立大鼠CCI模型：水合氯醛麻醉大鼠，暴露大鼠右后肢的坐骨神经，4－0铬制羊肠线环绕坐骨神经干做4个轻度结扎环，单结固定，间距1mm，结扎松紧程度以右后肢轻微的颤动为宜。假手术（Sham）组动物仅暴露坐骨神经并进行穿线操作但不实施结扎。

1．2．3 自发痛的测定 参照文献［5－6］稍作修改后，进行自发性疼痛行为观察与行为学评分。将大鼠置于透明有机玻璃盒（26cm×13cm×16cm，底部由网状铁丝构成），适应5min后，记录大鼠术侧足5min内自发性抬足时间（动物理毛或走动引起的抬足时间不计在内），观察术侧足姿势并进行评分。实验过程出现术侧足自噬而无法观测的动物淘汰。自发痛测定采用双盲设计。

1．2．4 实验方案

1．2．4．1 单次给予钩吻素子方案 大鼠随机分为Sham＋生理盐水（saline）组，Sham＋钩吻素子高剂量（7．0mg／kg）组，CCI＋saline组，CCI＋钩吻素子高、中、低剂量（7．0，1．4，0．28mg／kg）组。测基础自发性抬足时间和足姿势评分；大鼠行坐骨神经CCI术或Sham术（记为第0d，下同），术后第3d测给药前自发性抬足时间和足姿势评分，随后大鼠皮下注射钩吻素子（7．0，1．4，0．28mg／kg）或生理盐水，给药体积为4mL／kg，1h后测给药后自发性抬足时间和足姿势行为学评分。

1．2．4．2 连续给予钩吻素子方案 大鼠随机分为Sham＋saline组、CCI＋saline组、CCI＋钩吻素子（7．0，0．28mg／kg）2个剂量组。测基础自发性抬足时间和足姿势评分；大鼠行坐骨神经CCI术或Sham术，术后第3d测给药前自发性抬足时间和足姿势评分，随后大鼠皮下注射钩吻素子（7．0，0．28 mg／kg）或生理盐水，给药体积为4mL／kg，连续给药7d，每天2次，在术后第3，5，7，9d上午给药1h后测大鼠给药后自发性抬足时间和足姿势评分。

1．3 评分标准 0分：术侧足自然放于地面，无可见的异常情况；1分：术侧足轻触地面，但足趾并拢；2分：术侧足轻触地面，足趾并拢并且拱起；3分：术侧足仅足跟或内侧缘着地；4分：术侧足后翻，自发抬足。

1．4 统计学处理 数据以中位数（第一四分位数～第三四分位数）［M（Q1～Q3）］表示，统计处理由SPSS 11．5版统计软件完成。组间差异采用Kruskal－Wallis秩和检验，组内两两比较采用Mann－Whitney检验。

2 结 果

2．1 单次给予钩吻素子对CCI大鼠自发痛的效应

2．1．1 自发性抬足 术前大鼠均未见自发性抬足。Sham大鼠在实验期间未见术侧自发性抬足；术后CCI大鼠术侧足自发性抬足时间高于Sham大鼠（P＜0．01）；CCI大鼠单次皮下注射给予溶剂生理盐水后自发性抬足时间与给药前比无显著变化（P＝0．597），但CCI大鼠单次皮下注射给予高、中、低剂量钩吻素子后，减少自发性抬足时间，作用呈剂量依赖性（P＜0．01），其中高剂量组与溶剂对照组比，差别有统计学意义（P＜0．01）。术侧足自发性抬足时间见表1。

表1 单次皮下注射给予钩吻素子对CCI大鼠术侧自发性抬足时间的影响Tab 1 Effect of acute subcutaneous administration of Koumine on spontaneous foot－lifting time in rats with CCI neuropathy

2．1．2 术侧足姿势 术前动物评分均为0。Sham大鼠评分在实验过程均为0。CCI大鼠给药前评分增加，动物100%为4分；CCI大鼠单次皮下注射给予溶剂生理盐水后，足姿势评分与给药前比，无明显改变（P＝0．317），但CCI大鼠单次皮下注射给予高、中、低剂量钩吻素子后，足姿势评分降低，呈剂量依赖性，其中高、中剂量评分中位数均已降至2分，差别有统计学意义（P＜0．01，P＜0．05），尤其高剂量组足姿势评分构成比以2分为主，甚至出现1分的评分。术侧足姿势评分见表2和图2。

2．2 连续给予钩吻素子对CCI大鼠自发痛的效应

2．2．1 自发性抬足 术前大鼠均未见自发性抬足，Sham大鼠在实验过程亦未见；CCI大鼠在术后第3d自发性抬足时间显著升高（P＜0．01），CCI＋saline组在随后1周都维持较高水平。钩吻素子处理组较之CCI＋saline组自发性抬足时间有所减少，随剂量增加，减少越明显。高剂量组在术后第3，5，7，9d自发性抬足时间均低于CCI＋saline组，差别有统计学意义（P＜0．01）。各组术侧足自发性抬足时间见表3。

2．2．2 术侧足姿势 术前动物评分构成比100%为0，即均为正常状态，Sham大鼠评分在实验过程亦构成比100%为0；术后第3d，CCI大鼠评分增加，出现2～4分的评分，其中4分的构成比超过50%，CCI＋saline组在随后1周评分都维持较高水平，其中4分的构成比约占77%以上。钩吻素子处理组较之CCI＋saline组姿势评分有所降低，随剂量增加，降低越明显；随疗程的推移，疗效有增强的趋势。高剂量组在术后第3，5，7，9d评分均低于CCI＋saline组，差别有统计学意义（P＜0．05或P＜0．01），到术后第9d疗效最强，中位数为2分，构成比中4分比重已降至10%以下，改善为2～3分为主，并出现1分的评分。各组术侧足姿势评分见表4和图3。

表2 单次皮下注射给予钩吻素子对CCI大鼠术侧足姿势评分的影响Tab 2 Effect of acute subcutaneous administration of Koumine on paw postural index in rats with CCI neuropathy

表3 连续皮下注射给予钩吻素子对CCI大鼠术侧自发性抬足时间的影响Tab 3 Effect of repeated subcutaneous administration of Koumine on spontaneous foot－lifting time in rats with CCI neuropathy

表4 连续皮下注射给予钩吻素子对CCI大鼠术侧足姿势评分的影响Tab 4 Effect of repeated subcutaneous administration of Koumine on paw postural index in rats with CCI neuropathy

3 讨 论

图2 单次皮下注射给予钩吻素子对CCI大鼠术侧足姿势评分构成比的影响Fig 2 Effect of acute administration of Koumine on CCI－induced foot deformity in terms of postural index

图3 连续皮下注射给予钩吻素子对CCI大鼠术侧足姿势评分构成比的影响Fig 3 Effect of repeated administration of Koumine on CCI－induced foot deformity in terms of postural index

自发痛是NPP的重要组成之一，但由于自发痛具有强烈的主观性，不易测定，因而在研发NPP的镇痛药物过程中往往很少见到文献报道药物对自发痛的药效评价［1－2］，大多是针对易于定量评价的诱发痛进行，并基于对诱发痛的有效性即报道该药可能有良好的临床应用价值，但很多药物进入临床后却未见良效，可能原因之一是其忽视了对自发痛的评价，不能很好地模拟临床症状，从而得出假阳性的结果。尽管自发痛具有主观性，但多年来也研发出多种自发痛的测定方法，并不断改进完善，如自发性疼痛行为学测定法、条件偏爱实验法、承重减轻评价法、大小鼠面部表情评分法等［5－9］。其中，自发痛行为学测定法是最经典且易于普通实验室开展的。

自发痛行为学测定法通常包括足姿势评分和自发性抬足时间测定。足姿势评分是Attal于1990年根据福尔马林试验改进建立的自发痛评分方法（0～5分），随后有不同实验室对评分标准进行了改良，如最后一级评分“舔术侧足”后来被认为是很少见的，因而随后评分等级改为0～4分，并成为普遍采用的评分等级［5，8，10］。但具体0～4分标准的定义还是有所差别，如第3分的评分标准：Attal等为“术侧足仅后跟着地且后翻”［5］，而Kupers等为“仅内侧缘着地”［10］；笔者在预实验过程发现这两种情况并不常见，而且在同一只动物上并不一定同时出现。又如Kupers等在足趾形态上分级更细，选用不同标准可能评出的自发痛等级可能不同［10］，因此，本研究对二者的评分作了综合改进，以期更客观评价自发痛。预实验还发现若观察箱采用玻璃底面，动物的排泄物干扰观察，不易观察到后翻、仅内侧缘或足后跟着地的现象，相邻评分等级有时不易界定；后改用网格底面，排泄物的干扰减少，上述自发痛现象更容易观察且界定更清晰。Attal等发现自发痛在动物CCI术后第1～2d即可出现［5］。为了初步判断钩吻素子是否有抗NPP中自发痛的作用，本研究选择了术后第3d进行初筛。术后第3d，Sham大鼠未见明显自发性抬足和足姿势改变，提示Sham术本身对动物无显著影响；CCI大鼠出现明显足姿势改变、自发性抬足次数增多（抬足时间中位数为4．8s），而且CCI大鼠的自发痛是很持久的，在术后第3～9d足姿势评分和自发性抬足时间均维持较高水平，与文献报道一致［5－6］，提示 NPP自发痛模型建立成功。

本研究在自发痛模型基础上评价钩吻素子的抗自发痛作用，发现单次给予钩吻素子可剂量依赖性降低CCI大鼠自发性抬足时间和改善足姿势评分，而对Sham大鼠无影响，提示单次给予钩吻素子可能具有抗自发痛的作用。进而采用连续给予的给药方案进一步观察，发现钩吻素子高剂量有确切的逆转足姿势评分和自发性抬足时间的作用，进一步提示钩吻素子具有抗自发性疼痛的作用。与对照组比较，给予钩吻素子的大鼠在实验过程未见明显的镇静作用，大鼠的自主活动与其他组比，无明显差别，提示钩吻素子对大鼠自发痛的治疗作用不属于非选择性的镇静作用。

笔者认为，钩吻素子具有抗实验性NPP中自发痛的作用，预期该结果可以为钩吻素子研发为新型镇痛药提供药效学依据。

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