人结肠癌耐药细胞系SW480／L－OHP的建立及其耐药机制初探

张南文，许建华

结直肠癌属于我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈现较明显上升态势，在大中城市中更加明显［1］。近年来，各种新技术的应用和发展使得结直肠癌的治疗效果得到不断提高［2］，但第三代铂类配合物奥沙利铂（oxaliplatin，L－OHP）仍是临床上结直肠癌患者化疗最常用的抗癌药物之一。L－OHP在广泛应用的同时也导致了耐药性出现的严重问题［3］。本实验以L－OHP为诱导剂，以递增SW480细胞培养液中药物浓度的方式，建立人结肠癌SW480／L－OHP细胞模型，通过和SW480细胞对比，对其生物学特征及产生耐药的机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 SW480人结肠癌细胞系 由福建医科大学新药研究所惠赠。

1．1．2 试剂与药品 四甲基偶氮唑蓝（MTT，美国Amresco公司），二甲基亚砜（DMSO，国药集团化学试剂有限公司），DMEM培养基（美国Gibco公司），新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），艾恒（L－OHP，江苏恒瑞医药股份有限公司），罗丹明123（Rhodamine123，Rh123，美国Sigma公司），阿霉素（ADM，浙江海正药业股份有限公司），顺铂（DDP，齐鲁制药有限公司），5－氟尿嘧啶（5－FU，上海旭东海普药业有限公司）。

1．1．3 主要仪器 培养箱（HEPA CLASS 100，美国Thermo Forma公司），倒置显微镜（XDS－1B，日本Olympus公司），酶标仪（Microplate Reader 450，美国Bio－Rad公司），台式高速离心机（TGL－18C－C，上海安亭科学仪器厂），流式细胞仪（FACS Calibur，美国BD公司）。

1．2 方法

1．2．1 细胞培养 将人结直肠癌SW480细胞接种在含有10%新生小牛血清、100U／mL青霉素和100μg／mL链霉素的 DMEM 培养基中，放入37℃、体积分数为0．05的CO2饱和湿度培养箱内培养。用含0．02%EDTA的胰酶（0．125%）消化，收集离心去上清，重悬后传代，以台盼蓝法在细胞计数板上统计活细胞数量。

1．2．2 耐药细胞系SW480／L－OHP细胞的构建采用逐步递增培养液中L－OHP浓度、间歇诱导的方法，从1μg／mL（1／10IC50）开始，48h后弃去含药培养液，更换新鲜无药培养液，等到恢复正常生长后，再次加入相同浓度药物进行诱导，如此反复，逐 步 提 高 （1μg／mL→2μg／mL→3μg／mL→4μg／mL→5μg／mL→6 μg／mL→7μg／mL→8μg／mL），间歇诱导。

1．2．3 测定SW480与SW480／L－OHP细胞生长曲线和群体倍增时间 将对数生长期细胞消化离心后，均调整细胞数为2．5×104mL－1，分别接种于96孔板，每隔24h分别取3个复孔计算1次活细胞数量，共计算7d，以每天的活细胞数量计算群体倍增时间，公式如下：

TD＝t×log2／（logNt－logNo）

TD：群体倍增时间，t：培养时间，N0、Nt分别代表接种后及培养t小时后的细胞数。

将两种细胞接种于96孔板（共8块），每孔200μL（每孔5×103），各细胞设6个复孔，每天取1块板，每孔加 MTT（5mg／mL）20μL，培养4h，离心并小心弃去上清，各孔加150μL DMSO，充分振荡后，自动酶标仪上测各孔吸光度值（OD570）。以t为横坐标，以OD570值为纵坐标，绘出生长曲线。

1．2．4 MTT法测定SW480和SW480／L－OHP细胞药物敏感性 将对数生长期的细胞消化离心后，调整细胞悬液为4×104mL－1。按每孔190μL细胞悬液接种于96孔培养板，培养24h后，加入等比稀释成5种浓度的4种抗肿瘤药各10μL，以及阳性对照组及阴性对照组，各浓度设5个复孔，再培养48h后，MTT法测出各孔OD570。实验重复3次。计算各浓度药物的抑制率：

并算出4种抗肿瘤药物对2种细胞的半数抑制浓度（IC50）和耐药指数（RI）：［4］

1．2．5 流 式 细 胞 仪 （FCM）检 测 SW480 与SW480／L－OHP细胞周期分布 收集细胞后PBS洗2遍，离心并小心去掉上清液，慢慢添加－20℃预冷的体积分数为0．70的乙醇，固定1h。PBS洗2遍后，将等体积的细胞悬液与PI染液混合，避光4℃孵化10min，稍混匀，经200目尼龙膜过滤到流式管中，再加入1mL的PBS，使用FCM进行细胞周期分析。

1．2．6 细胞内Rh123累计的测定 用含0．02%EDTA的胰酶（0．125%）消化处于对数生长期的SW480细胞和SW480／L－OHP细胞，用无血清培养液将细胞调整为密度1×106mL－1的单细胞悬液，分装在EP管中，实验组分别加入Rh123（终浓度为2μg／mL），置于饱和湿度培养箱中孵育50min，离心，PBS缓冲液洗2遍，再重悬于冷PBS缓冲液中。FCM检测细胞内平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI），Ex 488nm，Em 530nm，观察对细胞内Rh123的含量。

1．3 统计学处理 采用SPSS 13．0统计软件进行分析。计量资料用±s表示，样本均数比较采用成组t检验，P＜0．05为差别具有统计学意义。

2 结 果

2．1 SW480／L－OHP耐药细胞的建立及耐药稳定性 历时约8月的反复诱导，终获得1株能在含8μg／mL L－OHP培养液中良好生长的耐药细胞系SW480／L－OHP。MTT 法 测 出 SW480 细 胞 对L－OHP的 IC50为 （11．34±3．52）μg／mL，而SW480／L－OHP细胞的IC50为（70．43±7．98）μg／mL，RI为（6．23±2．33）（P＜0．01）。在无药培养液中培养1月后，继用MTT法测定SW480／L－OHP细胞对L－OHP的IC50为（59．6±7．11）μg／mL，RI为（5．27±1．89），耐药性仍保持原有的84．7%，与撤药前比较无明显差别（P＞0．05）。冻存3月的SW480／L－OHP细胞复苏后生长状态良好，其对L－OHP的IC50值为 （58．1±4．69）μg／mL，RI为（5．14±2．16），与正常培养的细胞比较，差别无统计学意义（P＞0．05），耐药性保持稳定。

2．2 细胞生长曲线和细胞群体倍增时间 细胞生长曲线显示（图1），耐药细胞株SW480／L－OHP较SW480细胞群体倍增时间稍延长，分别为（59．51±2．52）h和（33．06±1．88）h，生长增殖速度减慢，差别有统计学意义（P＜0．05）。

图1 SW480细胞与SW480／L－OHP细胞的生长曲线Fig 1 The growth curve of SW480cells and SW480／L－OHP cells

2．3 SW480和SW480／L－OHP细胞对4种抗肿瘤药物的敏感性 SW480和SW480／L－OHP细胞对其他3种抗肿瘤药物5－FU、ADM及DDP的IC50见表1，SW480／L－OHP细胞对3种药物RI值分别为（2．02±1．02），（1．93±0．88）和 （1．44±0．64）（P＜0．05）。

2．4 细胞周期分布 经FCM进行细胞周期分布显示，SW480／L－OHP细胞呈现 G2／M 期阻滞现象（图2）。与SW480细胞的G2期为（11．67±1．19）%比较，SW480／L－OHP 细 胞 的 G2期细 胞 上 升 至（15．33±1．86）%，差别有统计学意义（P＜0．05）。

2．5 细胞P－gp功能 SW480细胞内Rh123浓度（MFI）为（48．70±1．90）%，SW480／L－OHP细胞内Rh123浓度（MFI）减少至（16．43±1．79）%，差别具有统计学意义（P＜0．01，图3）。

表1 SW480与SW480／L－OHP细胞的药物IC50比较Tab 1 The IC50of different drugs on SW480cells and SW480／L－OHP cells

图2 流式细胞仪观察SW480与SW480／L－OHP细胞周期分布Fig 2 The cell cycle phase distribution of SW480cells and SW480／L－OHP cells by FCM

图3 流式细胞仪测定细胞内Rhodamine123蓄积量Fig 3 The intracellular accumulation of Rhodamine123assessed by FCM

3 讨 论

结直肠癌化疗失败的主要因素是细胞对抗癌药物产生耐药，这也是引起肿瘤复发的主要因素之一。体外诱导构建耐药细胞株仍是研究耐药细胞生物学变化及肿瘤耐药机制的基础［5］。国内外专家学者已建立了多种肿瘤多药耐药（MDR）细胞系，构建一株理想的MDR细胞系是研究其发生机制不可或缺的重要手段，也是探索MDR逆转剂的必要条件［6］。

本研究以第三代铂类——L－OHP为诱导剂，先从1／10IC50的浓度（1μg／mL）开始，逐渐增加培养液中L－OHP浓度以间歇诱导，成功构建人结肠癌奥沙 利 铂 耐 药 细 胞 模型 SW480／L－OHP，RI为（6．23±2．33），且对5－FU、ADM、DDP等其他化学结构和（或）作用机制不一样的抗肿瘤药也产生了一定的耐药性。参考Snow和Judd文章［7］，RI＜5认为是低度耐药，RI为5～15是中度耐药，而RI＞15归为高度耐药。依照此标准界定，则SW480／L－OHP细 胞 对 L－OHP 是 中 度 耐 药，对5－FU、ADM、DDP等药物也具有低度耐药，说明耐药细胞系SW480／L－OHP细胞具有多药耐药特征。

通过绘制细胞的生长曲线，并且计算待测细胞的群体倍增时间，均可发现：相对于SW480细胞，SW480／L－OHP细胞的增殖生长速度有所减慢；同时，群体倍增时间明显延长。肿瘤细胞的群体倍增时间越短，表明化疗药物对其较敏感，疗效较好；反之，如果细胞群体倍增时间延长，则说明化疗药物对其敏感性下降［8］。FCM 检测 SW480／L－OHP细胞的结果显示，其细胞周期出现G2／M期阻滞现象，G2期细胞增多，证明其与SW480细胞相比，出现生长速度减慢的特征。

P－gp是目前研究较深入的ABC蛋白家族成员之一，产生多药耐药的机制之一可能是其高表达造成的，P－gp与抗癌药物及亲脂疏水性化合物相结合后，以水解ATP来供能，能逆浓度梯度将已经进入细胞内的药物泵到细胞外去，导致胞内药物含量减少而产生耐药［9］。由于罗丹明是P－gp的良好底物，且具有较好的特异性，本实验使用罗丹明蓄积实验法，检测耐药与亲本细胞P－gp功能改变情况，样本经由FCM检测分析显示，SW480／L－OHP细胞内罗丹明的蓄积量较SW480细胞明显减少，表明细胞主动外排系统增强，可能是产生其耐药性的生化机制之一。

综上所述，本实验构建的人结肠癌耐药细胞系SW480／L－OHP，耐药性较稳定且具备多药耐药性。在今后的研究中，课题组将继续诱导并深入研究和探讨肿瘤细胞对L－OHP耐药的机制，并以此模型探索和筛选理想的逆转耐药的新药。

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