钩吻素子无吗啡样药物依赖性

许 盈，丘宏强，沈 洁，庄伟霞，庄家庆，郑光渝，俞昌喜

钩吻素子在多种实验性疼痛模型上呈现显著的抗慢性疼痛药理作用，如慢性炎性疼痛、外周神经损伤所致的神经病理性疼痛，且治疗指数大［1］，提示钩吻素子有开发为临床镇痛药的潜在价值。阿片类镇痛药是目前临床应用的重要镇痛药，但限制这类药物使用的最大障碍是药物依赖性。钩吻素子是否有产生吗啡样药物依赖性的潜力有待研究。本研究在离体和整体动物水平考察钩吻素子产生吗啡样身体依赖性和精神依赖性的潜力，为其新药创制提供药物依赖性方面的实验依据。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 动物 成年雄性豚鼠4只，体质量350～450g，清洁级［上海市松江区松联实验动物场，许可证号：SCXK（沪）2007－0011］。健康雄性ICR小鼠79只，体质量18～23g，清洁级［上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2009－0005］。

1．1．2 药品与试剂 钩吻素子粉末，本课题组分离纯化，纯度达99．1%。盐酸纳洛酮（美国Sigma公司）；卡巴胆碱（批号：10082603，山东博士伦福瑞达制药有限公司）；盐酸吗啡注射液（批号：041106，沈阳第一制药厂）；其余试剂均为分析纯。

1．1．3 仪器 多道生理信号采集处理系统（RM6240，成都仪器厂）；条件性位置偏爱仪（Dig－Behv－4CPPug，上海吉量软件科技有限公司）；精密电子天平（ER－182A，日本AND会社）。

1．2 方法

1．2．1 离体豚鼠回肠药物依赖模型 豚鼠回肠药物依赖模型，参照文献［2］改动建立：雄性豚鼠禁食12h、不禁水，击头处死，立即取回肠末端20cm，弃盲肠端5cm，置于Krebs液中，修剪回肠周围脂肪组织及血管，用Krebs液洗净肠内容物，剪切成长约2．0～3．0cm的标本，安置于37℃恒温浴槽中，加Krebs液10mL，通气（95%O2＋5%CO2），调前负荷1g，每10min换液1次，标本稳定后，用含吗啡（终浓度为4μmol／L）或钩吻素子等（见后实验方案）的Krebs液孵育4h，建立豚鼠回肠标本药物依赖模型，加入纳洛酮（终浓度为4μmol／L）催促戒断症状（特异性收缩），记录纳洛酮催促戒断收缩张力。Krebs液洗脱药物，稳定后，加入卡巴胆碱（终浓度为1μmol／L），记录回肠肌最大收缩张力。按下式计算纳洛酮催促戒断收缩百分率：

1．2．2 身体依赖性试验 身体依赖模型参照文献［3］改动：皮下注射吗啡（首日10mg／kg，逐日递增10mg／kg）或钩吻素子等（见后实验方案），每天2次（9∶00，17∶00），连续7d，建立小鼠对药物的身体依赖。

催促戒断反应：第8d上午皮下注射吗啡（80mg／kg）或钩吻素子等（见后实验方案），2h后腹腔注射盐酸纳洛酮（6mg／kg），随即放入高35cm，直径为30cm的玻璃缸中，观察给予纳洛酮后20min内小鼠的跳跃次数和纳洛酮给药前后1h的体质量下降量。

自然戒断反应：第8d继续给予小鼠吗啡（80mg／kg）或钩吻素子等（见后实验方案），未施加纳络酮；第9d起停止给予吗啡，测定从给药首日到停药后6d小鼠的体质量变化。

1．2．3 精神依赖性试验 精神依赖性试验采用的是条件性位置偏爱实验，参照文献［4］改动，由预测试、训练和测试三个阶段组成。预测试阶段（第1～3d），黑白箱连通，让小鼠自由探索整个箱体15min，每天1次，连续3d。记录小鼠第2～3d在黑、白箱的平均停留时间。预测试结果显示小鼠在黑箱中停留时间大于在白箱中的停留时间，规定训练阶段以小鼠非偏爱侧白箱作为伴药箱。训练阶段（第4～9d）：黑白箱隔断训练，其中第4，6，8d小鼠皮下注射干预药物后，随即置于伴药箱白箱中训练30min；第5，7，9d小鼠皮下注射生理盐水后，随即置于非伴药箱黑箱中训练30min。测试阶段（第10d），将小鼠放入抽掉隔板的偏爱箱中间位置，观测15min，记录小鼠在伴药箱白箱的停留时间。

1．2．4 实验方案

1．2．4．1 钩吻素子离体豚鼠回肠吗啡样戒断症状的观察 豚鼠回肠标本随机分3组：吗啡组、钩吻素子组和对照组，分别用含吗啡（终浓度为4μmol／L）、钩吻素子（终浓度100μmol／L）和不含药物的Krebs液孵育4h，建立豚鼠回肠药物依赖模型，测定纳洛酮催促戒断收缩张力和标本最大收缩张力，计算纳洛酮催促戒断收缩百分率，离体水平观察钩吻素子是否具有吗啡样戒断症状。

1．2．4．2 钩吻素子小鼠吗啡样身体依赖戒断症状的观察 催促戒断症状：小鼠随机分为吗啡组、钩吻素子组和对照组，每组8只。吗啡组按上述方案给予吗啡，钩吻素子组和对照组则分别皮下注射钩吻素子（10mg／kg）和等体积生理盐水，第8d上午给药2h后，观测纳洛酮催促小鼠戒断跳跃次数以及体质量变化。自然戒断症状：未施加纳洛酮，组别设计同催促戒断症状，观测实验过程小鼠体质量变化。

1．2．4．3 钩吻素子小鼠吗啡样精神依赖的条件性位置偏爱效应的观察 小鼠随机分为吗啡组、钩吻素子组和对照组，每组10只。按上述方案进行预测试、训练和测试。训练阶段各组干预药物：吗啡组为6mg／kg吗啡，钩吻素子组为10mg／kg钩吻素子，对照组为等体积生理盐水。测定小鼠在伴药箱中的停留时间，判断钩吻素子是否具有吗啡精神依赖样的条件性位置偏爱效应。

1．3 统计学处理 采用SPSS 11．5版本统计软件。跳跃次数数据以中位数（第一四分位数～第三四分位数）［M（Q1～Q3）］表示，组间差别采用Kruskal－Wallis秩和检验，组内两两比较采用Mann－Whitney检验。其他数据以±s表示，组间差别采用单因素方差分析，若方差齐性，组内两两比较采用LSD检验；若方差不齐，组内两两比较采用Dunnett T3检验。

2 结 果

2．1 钩吻素子离体豚鼠回肠吗啡样戒断反应观察纳洛酮催促戒断收缩反应百分率经单因素方差分析显示，组间差别有统计学意义（F＝17．209，P＜0．01）。对照组豚鼠回肠标本不出现收缩或仅引起较小幅度不规则收缩，纳洛酮催促戒断收缩百分率仅为（3．6±4．7）%；吗啡组则促发戒断症状，即特异性收缩反应：迅速出现大幅度的强直性收缩，维持1～2min逐渐恢复至正常水平，纳洛酮催促戒断收缩百分率（34．2±13．0）%，远高于对照组，差别具有统计学意义（P＜0．01）；钩吻素子组则出现小幅度收缩，纳洛酮催促戒断收缩百分率（10．4±4．1）%，低于吗啡组，差别具有统计学意义（P＜0．01），略高于对照组，但差别无统计学意义（P＝0．873）。

2．2 钩吻素子小鼠吗啡样身体依赖戒断反应的观察

2．2．1 钩吻素子小鼠吗啡样身体依赖催促戒断反应的观察 吗啡组给予吗啡后出现竖尾、跑动增加的兴奋活动。钩吻素子组和对照组未出现类似活动。纳洛酮催促戒断后，吗啡组出现腹泻、跳跃、前爪震颤和“湿狗”样抖动等明显的戒断症状；对照组和钩吻素子组未见上述表现。经测定，纳洛酮催促戒断跳跃次数和体质量下降量见表1。Kruskal－Wallis秩和检验显示跳跃次数组间差别具有统计学意义（χ2＝15．472，P＜0．01），单因素方差分析显示体质量下降量的组间差别具有统计学意义（F＝8．026，P＜0．01）。组内两两比较显示，吗啡组跳跃次数和体质量下降量显著高于对照组，差别均具有统计学意义（P＜0．01）；钩吻素子组腹腔注射纳洛酮后，跳跃次数和体质量下降量显著低于吗啡组，差别均具有统计学意义（P＜0．01），但与对照组比较，差别均无统计学意义（P＝0．144和P＝0．406）。

表1 钩吻素子诱导小鼠吗啡样身体依赖催促戒断症状的潜力Tab 1 Potential of inducing mouse morpine－like physical dependence precipitated withdrawal symptoms in mice by Koumine

2．2．2 钩吻素子小鼠吗啡样身体依赖性自然戒断症状的观察 对照组体质量逐日递增；与对照组比较，吗啡组在给予吗啡1d后体质量增长慢，给予吗啡2d后体质量显著下降（P＜0．01），给予吗啡3d后体质量开始恢复，但均低于对照组；其中第3～6d差别具有统计学意义（P＜0．01），第7d开始明显恢复；但第10d体质量再次显著降低（P＜0．01），随后体质量有所增长，但始终低于对照组，差别具有统计学意义（P＜0．01）（图1）。实验过程钩吻素子组小鼠体质量变化趋势同对照组，差别无统计学意义（P＞0．05）。吗啡停用后，吗啡组出现不安、“湿狗”样抖动等自然戒断症状；钩吻素子组在钩吻素子停药前后，行为学无显著改变。

图1 钩吻素子诱导小鼠吗啡样身体依赖自然戒断症状的潜力Fig 1 Potential of inducing natural morphinelike physical dependence withdrawal symptoms in mice by Koumine

2．3 钩吻素子小鼠吗啡样精神依赖性条件性位置偏爱效应的观察 预测试显示小鼠黑箱停留时间略高于白箱，规定白箱为伴药箱，单因素方差分析显示组间白箱停留时间差别无统计学意义（F＝0．045，P＝0．957）。经训练后，组间白箱停留时间差别有统计学意义（F＝5．055，P＜0．05），吗啡组在伴药箱的停留时间高于对照组，差别具有统计学意义（P＜0．01）；钩吻素子组在伴药箱停留时间低于吗啡组，差别具有统计学意义（P＜0．05），与对照组比较，差别无统计学意义（P＝0．833）（图2）。

图2 钩吻素子诱导小鼠吗啡样精神依赖性条件性位置偏爱效应的潜力Fig 2 Potential of Koumine inducing mouse morphine－like psychological dependence place preference in mice by Koumine

3 讨 论

药物依赖性是限制药物（特别是镇痛药）临床应用的重要原因之一。前期研究提示，钩吻素子具有潜在治疗慢性疼痛的临床应用价值［1］。慢性疼痛需要长期用药，钩吻素子是否具有自身依赖性亟需考察。本研究就钩吻素子是否具有吗啡样药物依赖性（包括身体依赖和精神依赖）进行评价。

首先在离体水平采用经典的豚鼠回肠实验初步评价钩吻素子的吗啡样身体依赖性潜力。吗啡孵育豚鼠回肠标本出现特征性纳洛酮催促戒断收缩反应，同文献报道［2，5］，提示吗啡依赖豚鼠回肠模型建立成功。以往多数文献采用“纳洛酮戒断收缩张力”为指标评价药物是否具有身体依赖性潜力，但该指标未考虑到标本本身的收缩性能差异以及仪器各通道敏感性差别。为消除这些因素的影响，本研究选用“纳洛酮催促戒断收缩反应百分率”为指标定量评价钩吻素子的身体依赖性潜力。结果发现，在25倍于吗啡浓度的钩吻素子孵育豚鼠回肠标本中，纳洛酮催促收缩反应百分率虽增高但差别无显著性，提示钩吻素子不具有诱导豚鼠回肠表达吗啡样戒断反应的潜力。

随后在整体动物水平采用经典的催促戒断和自然戒断实验进一步观察钩吻素子的身体依赖性潜力。前期研究表明，2～10mg／kg钩吻素子具有显著抗炎性疼痛的作用，因而本研究在整体动物水平选择高剂量10mg／kg作为钩吻素子自身依赖性潜力评价的给药剂量。

催促戒断实验发现，吗啡组纳洛酮催促后很快出现多而纷乱的自发活动、重复的刻板式跳跃、排便、体质量下降等典型戒断反应，同文献报道一致［5］；以最为明显且客观的跳跃反应次数和体质量下降量为指标定量评价钩吻素子诱导吗啡身体依赖样催促戒断症状的潜力，结果表明，纳洛酮催促后，吗啡组小鼠跳跃反应次数显著增加、体质量下降量明显，与文献报道一致［5－6］，提示成功诱导吗啡身体依赖样催促戒断症状。钩吻素子组未见类似现象，提示钩吻素子不具有诱导小鼠产生吗啡样身体依赖催促戒断症状的潜力。

由于自然戒断实验的戒断体征和行为变化出现晚，持续时间长，定量观察比较困难，但吗啡身体依赖致小鼠体质量下降是较为客观的［5］，因此以体质量变化为指标定量评价钩吻素子诱导吗啡身体依赖样自然戒断症状的潜力。本研究观察到给予吗啡2d后，小鼠体质量即显著降低，推测吗啡可能引起小鼠急性生理功能紊乱而致体质量急剧下降，而后体质量逐渐恢复，特别是用药5d后，推测小鼠可能对吗啡产生适应性变化；吗啡停用后小鼠增质量减缓，与文献报道一致［5－6］，提示成功诱导吗啡身体依赖样自然戒断症状。而钩吻素子组未见类似变化，提示钩吻素子不具有诱导小鼠产生吗啡样身体依赖自然戒断症状的潜力。

综合豚鼠回肠实验、催促戒断和自然戒断实验结果提示，钩吻素子可能无产生吗啡样身体依赖性的潜力。

进而采用经典的条件性位置偏爱试验评价钩吻素子的吗啡样精神依赖性潜力。小鼠经吗啡和非偏爱箱（白箱）的伴药训练后，小鼠增加白箱的停留时间，与文献报道结果一致［4－5］，提示条件性位置偏爱模型成功建立；在此基础上评价钩吻素子的精神依赖性，结果初步显示钩吻素子并不产生吗啡精神依赖样条件性位置偏爱效应。由于阿片类药物的精神依赖性是导致药物滥用的最主要因素，钩吻素子不具有吗啡样精神依赖性，因此可能不易出现药物滥用现象，从而有利于其开发成临床药物后的广泛使用。钩吻素子无吗啡样精神依赖性是否具有种属差别，有待在更多层次的动物模型以及临床试验上进一步验证。

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