钩吻素子的基本理化性质及其水溶液稳定性

苏燕评，石冬梅，范振东，廖凯君，俞昌喜

钩吻素子为马钱科植物钩吻（GelsemiumelegansBenth．）所提取的生物碱单体中含量最高的一种有效成分，分子式C20H22N2O，相对分子质量为306．3［1］。本课题组先期工作采用高速逆流色谱技术从本地盛产的钩吻中分离纯化获得钩吻素子单体，分离周期短，得率高，纯度达99%以上［2］；研究发现钩吻素子具有显著的抗慢性疼痛作用、抗焦虑作用，且其有效剂量远离LD50［3－6］；钩吻素子能剂量依赖性地降低类风湿性关节炎的抗体产生，改善其肿胀、痛敏、关节炎指数等症状，逆转类风湿性关节炎关节病理性改变，提示钩吻素子具有抗类风湿性关节炎的作用［7］。基于上述研究结果，笔者认为钩吻植物中的活性成分钩吻素子具有创制新型药物的重大潜能，其剂型亟待研究。药物理化性质是药物制剂设计的基础，本研究拟探讨钩吻素子的基本理化性质及其水溶液稳定性，将为后续药物剂型的设计奠定基础。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 试剂 钩吻素子对照品为本课题组前期提取分离精制而成，经高效液相色谱（HPLC）鉴定，纯度为99．1%；甲醇（色谱纯，中国国药集团化学试剂有限公司）；甲醇、乙醇、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、正辛醇（均为分析纯，中国国药集团化学试剂）。

1．1．2 仪器 高效液相色谱仪（Angilent 1100型，美国 Angilent公司）；磁力搅拌器（ZNCL－S型，巩义市予华仪器有限责任公司）；精密电子天平（ER－182A型，日本AND株会社）；精密酸度计（pHS－407型，上海大普仪器有限公司）；台式高速冷冻离心机（TGL－16G型，上海安亭科学仪器厂）；恒温振荡器（SHZ－82型，常州国华电器有限公司）。

1．2 方法

1．2．1 钩吻素子含量高效液相色谱测定法

1．2．1．1 HPLC条件 依利特 Hypersil ODS2高效液相色谱柱（5μm，4．6mm×250mm），柱温25℃，流动相：甲醇－0．2%正丁胺水溶液（58∶42），检测器：二极管阵列检测器，流动相流速：1．0mL／min，检测波长：256nm。

1．2．1．2 标准曲线制备 以甲醇配制浓度分别为5．2，10．4，20．8，41．6，83．2和166．4μg／mL 的钩吻素子标准液，按上述HPLC色谱条件进样分析，以钩吻素子浓度Y（μg／mL）对峰面积X进行线性回归，得到标准曲线为：

Y＝9．526 2X－11．106

钩吻素子甲醇溶液在5．2～166．4μg／mL浓度范围内线性关系良好，r＝0．999 9。

1．2．1．3 方法学考察 配制浓度为20．2μg／mL的钩吻素子甲醇溶液，以上述HPLC法进样分析，显示甲醇溶液对钩吻素子的测定无干扰，该方法专属 性 良 好；分 别 配 制 浓 度 为10．4，41．6和166．4μg／mL的钩吻素子甲醇溶液，以上述 HPLC法进样分析，重复性试验显示高、中、低3个浓度的峰面积 RSD均＜3%，分别为0．97%，0．46%和0．53%，该法重复性良好（n＝5）；精密度试验显示日内 RSD均＜3%，分别为2．7%，2．1%和0．8%，回收率分别为99．8%，100．5%和102．5%，日间RSD均＜5%，分别为4．07%，3．48%和1．02%，该法精密度良好，回收率符合测定要求（n＝5）。

1．2．2 平衡溶解度测定法 分别配制pH为1．0的 HCl溶液和pH 为2．5，5．0，6．8，7．4和8．0的PBS缓冲液。取过量的钩吻素子原料药于具塞试管内，分别加入上述溶液及纯净水、甲醇、乙醇各1mL，超声溶解20min后放入恒温震荡器于25℃下震荡48h，100次／min，分别在6，12，24和48h取少量上层澄清液离心3min，10 000r／min，取上层溶液10μL，用甲醇稀释后HPLC法测定，根据标准曲线计算钩吻素子的含量。依据2010版中国药典关于溶解度的描述，判断钩吻素子在上述溶液中的溶解性能［8］。

1．2．3 表观油／水分配系数测定法 分别配制pH为1．0和3．0的 HCl溶液，pH 为6．8和7．4的PBS缓冲液，pH为9．0的NaOH溶液。以正辛醇为油相，上述不同pH溶液为水相，将油相和水相等体积混合后置于分液漏斗中，振摇后放置过夜，分层，下层为正辛醇饱和的水层，上层为水饱和的正辛醇层。

取浓度为4．06mg／mL钩吻素子溶液200μL，分别用上述下层溶液定容至2mL，得到浓度为406μg／mL的供试品溶液。分别精密移取各供试液1mL，加入上述上层溶液各1mL，涡旋少许后，置于恒温振荡器中于25℃下震荡72h充分平衡，100次／min。待平衡后，分离出水层和正辛醇层，用甲醇稀释10倍后HPLC法进样分析，依据标准曲线计算油相钩吻素子浓度C1和水相钩吻素子浓度C2，按下述公式计算钩吻素子的表观油／水分配分配系数P：并计算其对数值LgP［9］。

1．2．4 钩吻素子水溶液稳定性测定法 分别配制pH 为3．0，5．0，7．0，8．0的PBS溶液，精密移取浓度为2．7mg／mL钩吻素子母液200μL于5mL容量瓶中，分别用上述缓冲液定容至刻度，4，25，37℃下分别存放，于第0，2，5，15，25d各取样1次，HPLC法测定其含量，依据标准曲线计算钩吻素子浓度。以第0天测得的浓度为C0，其他时间点测得浓度为Ct，剩余百分率Cr＝Ct／C0［10－11］。以时间t为横坐标，Cr为纵坐标作图，考察钩吻素子含量变化。

2 结 果

2．1 钩吻素子的平衡溶解度 钩吻素子在不同介质中的平衡溶解度见表1，钩吻素子微溶于乙醇，溶解于甲醇，易溶于pH 2．5～8．0的PBS缓冲液和纯水；钩吻素子溶解度与溶液pH值相关，碱性条件下溶解度降低。

表1 钩吻素子在不同介质中的平衡溶解度（25℃）Tab 1 The solubility of Koumine in different medium at 25℃

2．2 钩吻素子的的表观油／水分配系数 钩吻素子的表观油／水分配系数在酸性和碱性条件中存在明显差异，酸性条件下表观油／水分配系数对数值LgP＜－1，钩吻素子在水相分配较多；在中性和碱性环境中LgP＞1，钩吻素子在油相分配较多。钩吻素子在碱性条件下亲脂性比酸性条件下高（表2）。

表2 钩吻素子在不同pH溶液中的表观油／水分配系数Tab 2 Partition coefficient of Koumine between oil and water phase with different pH

2．3 钩吻素子水溶液的稳定性 4℃和25℃时，不同pH 条件下（3，5，7，9）的钩吻素子水溶液放置25d后，钩吻素子的含量均在94．58%（Ct／C0）以上，钩素子水溶液在上述条件下稳定性良好；37℃时，pH 5，7或9条件下放置25d钩吻素子的含量≥97%，但在强酸（pH3）条件下放置5d，药物含量为原含量的94．85%，放置25d后为89．04%，在此条件下钩吻素子稳定性较差（图1）。

图1 不同pH钩吻素子水溶液在4℃，25℃和37℃下的稳定性Fig 1 Stability of Koumine in aqueous buffers at 4℃，25℃and 37℃

3 讨 论

钩吻素子属于单萜吲哚类生物碱，生物碱在不同溶剂中的溶解性能与结构中的N原子的存在、分子的大小、结构中官能团的种类和数目等因素有关［12］。平衡溶解度测定结果表明钩吻素子微溶于乙醇，溶解于甲醇，易溶于纯水、pH为1．0的HCl溶液和pH为2．5～8．0的PBS溶液中，为一中等极性水溶性生物碱，且溶解度与溶液pH值相关，碱性条件下钩吻素子溶解度降低。因此，在后续的钩吻素子缓释剂型研究中可选用符合水溶性药物特性的亲水凝胶骨架材料羟丙甲基纤维素；而在其缓释片释放度实验中，可采用pH 6．8磷酸盐缓冲液作为释放介质，此时钩吻素子释放符合漏槽条件。

表观油／水分配系数影响药物的透膜吸收，而药物的脂溶性大小是影响药物透膜吸收的重要因素之一［13］。一般而言，LgP较小的药物吸收较差，LgP＞1的药物吸收较好。钩吻素子进入胃部（酸性条件）后与胃酸生成生物碱盐，呈离子状态，此时分配系数小（LgP＜－1），在胃部吸收较少，生物碱盐进入小肠（碱性环境）后，还原成高浓度分子型游离碱，此时钩吻素子分配系数大（LgP＞1），亲脂性高，药物跨过生物膜吸收入体内。通过钩吻素子表观油／水分配系数的测定推断其主要吸收部位可能是小肠。

水溶液稳定性考察表明，在4℃和25℃时，不同pH（3，5，7，9）条件下钩吻素子水溶液稳定性均良好；在37℃时，钩吻素子水溶液在强酸（pH 3）条件下稳定性较差，因此钩吻素子的酸性水溶液要避免高温储存。

药物理化性质研究是药物制剂设计的基本环节，在此基础上才能有目的地选择适宜的剂型、辅料、制剂技术或工艺。本研究首次对钩吻素子平衡溶解度、表观油／水分配系数和水溶液稳定性等与口服缓释固体制剂密切相关的理化性质进行考察，为后续钩吻素子的剂型研究奠定基础。

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