山药中尿囊素最佳提取方法的优选△

易刚强，蒋孟良*，鲁耀邦，刘朝晖，钟振平，罗跃龙

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.药圣堂制药有限公司，湖南 安乡 415600)

中药工业

山药中尿囊素最佳提取方法的优选△

易刚强1，蒋孟良1*，鲁耀邦1，刘朝晖2，钟振平2，罗跃龙1

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.药圣堂制药有限公司，湖南 安乡 415600)

目的：优选尿囊素最佳提取方法。方法：以尿囊素含量为评价指标，采用高效液相色谱法测定20%乙醇与甲醇超声提取、20%乙醇与甲醇回流提取及水提法样品中尿囊素的含量。结果：提取的尿囊素含量由高到低顺序为甲醇超声提取2次>20%乙醇超声2次>甲醇超声1次>20%乙醇超声1次>甲醇回流1次>20%乙醇回流1次>水回流1次。结论：尿囊素以甲醇超声提取2次含量最高。

山药；尿囊素；提取方法；高效液相色谱；含量测定

山药为薯蓣科植物薯蓣DioscoreaoppositaThunb.的干燥根茎。具有补脾养胃、生津益肺、补肾涩精的作用。用于脾虚食少，久泻不止，肺虚喘咳，肾虚遗精，带下，尿频，虚热消渴[1]。山药是应用非常广泛、用量非常大的药食两用品种。山药中尿囊素具有促进细胞生长、加快伤口愈合、软化角质蛋白等生理功能，是皮肤创伤的良好愈合剂和抗溃疡药剂[2]；它还是糖尿病、肝硬化及癌症治疗药物的重要成分[2]。为了尽量多地提出山药中尿囊素有效成分，实验以尿囊素的含量为评价指标，优选其最佳提取方法。

1 材料与仪器

1.1 药品与试剂

山药经湖南省药品检验所方石林主任药师鉴定为薯蓣科植物薯蓣DioscoreaoppositaThunb.的干燥根茎；尿囊素(供含量测定用，中国食品药品检定研究院，批号：111501-201003)；甲醇(高效液相色谱淋洗剂，中国医药集团化学试剂有限公司，批号：T20111213)；无水乙醇(分析纯，安徽安特生物化学有限公司，乙醇含量≥99.7%，批号：T20110928)。

1.2 仪器

Agilent1200型高效液相色谱仪(包括紫外可见分光光度检测器，美国)；AB135-S型电子天平(0.01 mg，METTLER TOLEDO)；KL-UP-Ⅲ-20型艾柯超纯水机(成都唐氏康宁科技发展有限公司)；SK3300H型超声波清洗机(上海科导超声仪器有限公司)；DK-S22型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)。

2 方法

2.1 山药的不同提取方法

2.1.1 超声提取法 取山药细粉约1 g，4份，精密称定，第1份与第2份均加入20%乙醇50.0 mL，第3份与第4份加入甲醇50.0 mL，称重。第1份与第3份分别超声2次，每次30 min，两次之间间隔30 min；第2份与第4份分别超声1次(30 min)。超声完毕之后擦干瓶外侧的水，称重，用溶媒补足至原重，摇匀，即得。

2.1.2 回流提取法 取山药细粉约1 g，2份，精密称定，置烧瓶中，分别加入甲醇与20%乙醇各50.0 mL，置水浴中回流30 min，冷却之后擦干烧瓶外侧的水，称重，用溶媒补足至原重，摇匀，即得。

2.1.3 水提取法 取山药细粉约1 g，精密称定，置烧瓶中，加蒸馏水50.0 mL，置水浴中回流30 min，冷却之后擦干烧瓶外侧的水，称重，用水补足至原重，摇匀，即得。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱为ODS-C18柱，流动相为甲醇-水(5∶95)，流速为0.8 mL·min-1，柱温为30 ℃，检测波长为224 nm。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取尿囊素对照品10.20 mg，置10 mL量瓶中，加蒸馏水至刻度，精密吸取1.0 mL于10 mL量瓶中，加流动相至刻度，摇匀作为对照品溶液(0.102 mg·mL-1)。

2.2.3 供试品溶液的制备 分别精密吸取2.1项下的各提取液10.0 mL，置小蒸发皿中，水浴上蒸干，残渣加流动相适量使溶解，转移至10.0 mL量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，即得。再用针头式滤器(具0.45 μm微孔滤膜)滤过，备测。

2.2.4 线性关系的考察 精密吸取对照品溶液2，4，8，15，20 μL，分别注入高效液相仪中，照上述色谱条件分析，以尿囊素质量X(μg)为自变量，峰面积积分值Y为因变量进行线性回归，求得回归方程Y=342.09X+16.18，r=0.999 6，实验表明尿囊素在0.204～2.04 μg线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，重复进样6次，测定峰面积，尿囊素的平均峰面积为982.6，RSD=0.97%，表明仪器的精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 精密吸取供试品溶液10 μL，按上述色谱条件进行测定，其平均峰面积积分值为977.9，RSD=1.03%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.7 重复性试验 取同一批山药细粉约1 g，精密称定，加甲醇50 mL超声2次，每次30 min，再按2.2.3方法制备供试液，平行制备6份，分别精密进样10 μL，用外标法计算尿囊素含量，RSD=2.4%。

2.2.8 加样回收率试验 取已知含量(3.12 mg·g-1)的山药细粉约0.5 g，6份，精密称定，分别加入0.75 mg·mL-1的尿囊素2.0 mL，再加入甲醇50.0 mL，称重，分别超声提取2次，每次30 min，两次之间间隔30 min，超声完毕之后擦干瓶外侧的水，称重，用溶媒补足至原重，摇匀，分别精密吸取各提取液10.0 mL，置小蒸发皿中，水浴上蒸干，残渣加流动相适量使溶解，转移至10.0 mL量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，再用具0.45 μm微孔滤膜的针头式滤器滤过，取滤液依法测定，并计算回收率，结果表明，该方法回收率良好。见表1。

2.2.9 样品测定 分别精密吸取尿囊素对照品溶液与供试品溶液各10 μL，分别注入高效液相色谱仪中，依法测定，外标法计算含量，结果见表2、色谱图见图1。

表1 加样回收率试验

表2 不同提取方法尿囊素的含量(n=3)

结果表明，用甲醇超声提取2次，每次30 min，含量最高，其次为20%乙醇超声2次及甲醇超声1次，再次为20%乙醇超声1次与甲醇回流1次，20%乙醇与水回流含量最低。

A.尿囊素 B.山药图1 尿囊素对照品及山药HPLC图

3 小结与讨论

实验结果表明，不同提取方法的山药中尿囊素含量顺序是：甲醇超声提取2次>20%乙醇超声2次>甲醇超声1次>20%乙醇超声1次>甲醇回流1次>20%乙醇回流1次>水回流1次。从提取方法来看，超声优于回流；从溶媒来看，甲醇优于20%乙醇，水最差，这可能是在样品处理时甲醇沸点低，受热影响少而破坏少，而水的沸点最高，受热影响大而破坏多，20%乙醇在二者之间；从提取次数来看，以提取2次为佳，增加了近11个百分点，故尿囊素的提取采用甲醇超声提取2次。

据报道，HPLC法测定尿囊素含量的流动相有用甲醇-水(1∶9)[3-5]，本实验发现其分离效果并不好，其分离度不能达到分析要求；采用甲醇-磷酸二氢钾缓冲液(2∶98)[6-8]虽然分离效果更好，但此种比例的极性太大；还有采用纯水的[9-10]，这对色谱柱的损害较大。经摸索最后采用甲醇-水(5∶95)作为流动相，基本能够达到较好的分离效果，尿囊素出峰的时间大约在3.8 min左右。据文献报道[11]，尿囊素在碱性条件下不稳定，水解成脲、乙醛酸和尿囊素酸，因此稀对照品溶液及样品溶液最好在用前准备。

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OptimizationofExtractionMethodofAllantoininYam

YI Gang-qiang1，JIANG Meng-liang1*，LU Yao-bang1，LIU Zhao-hui2，ZHONG Zhen-ping2，LUO Yue-long1

(1.HunanUniversityofChineseMedicine，Changsha410208，China；2.YaoshengtangManufactureDrugCorporation，Anxiang415600，China)

Objective：To optimize allantoin extraction method fromDioscoreaoppositaThunb.Methods：Using allantoin content as the indexes，20% ethanol and methanol ultrasonic extraction，20% ethanol and methanol reflux extraction and water formulation samples were determined by HPLC.Results：The allantoin content：Methanol ultrasonic extraction 2 times>20% ethanol ultrasonic 2 times>methanol ultrasonic 1 time>20% ethanol ultrasonic 1 time>methanol reflux 1 time>20% ethanol reflux 1 time>water reflux 1 time.Conclusion：Methanol ultrasonic extraction 2 times has the highest allantoic content.

DioscoreaoppositaThunb.；Allantoin；Extraction methods；HPLC；Content determination

2013-02-05)

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产学研校企合作项目(YXY2010-002)

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蒋孟良，教授，硕士生导师，主要从事中药炮制与制剂研究，E-mail：hhjml@163.com