动物源性多重耐药大肠杆菌的分离与鉴定

隋 慧，杨金生

（1．辽宁医学院畜牧兽医学院，辽宁 锦州121001；2．吉林省畜牧兽医科学研究院，吉林 长春130062）

近几年来，大肠杆菌病给畜牧业造成的经济损失日趋严重，致病性大肠杆菌已经成为医学和动物医学临床感染中最常见的病原菌之一。临床上主要表现为脐炎、关节炎、腹膜炎、输卵管炎、眼球炎、败血症。每年死亡的幼猪中约有50%与产毒性大肠杆菌有关［1］，20世纪40年代以来，随着百余种抗菌药物的广泛使用，细菌对抗菌药物耐药已成为当今时代的一个特征。本试验对从辽宁省5个地区分离出的64株动物源性大肠杆菌进行了12种抗菌药物的耐药性监测与分析，从中选择多重耐药大肠杆菌7株供进一步研究用。

1 材料与方法

1．1 材料 普通营养肉汤、普通营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板、三糖铁琼脂斜面、半固体营养琼脂，均按常规方法自行配制。糖微量发酵管，由杭州天和微生物试剂有限公司提供。革兰染色试剂自配。药敏纸片：氧氟沙星（OFL）、庆大霉素（GM）、链霉素（S）、氨苄青霉素（AM）、四环素（TE）、复方新诺明（SXT）、环丙沙星（CIP）、妥布霉素（TM）、壮观霉素（SPT）、磺胺甲基异口恶唑（SMX）、氟哌酸（NOR）、头孢氨苄（CX），购自卫生部抗菌药物细菌耐药性监测中心。

菌株：大肠杆菌ATCC25922：为大肠杆菌质控标准株，购自白求恩医科大学细菌室；H10407：敏感性大肠杆菌，由吉林大学惠赠。病原性大肠杆菌：经过上述鉴定出的于2010年8月至2012年5月从沈阳、锦州、葫芦岛、阜新、抚顺地区共分离出64株动物病原性大肠杆菌。

氯霉素：购自中国兽医药品监察所，含量为99．5%，批号：890322。硫酸庆大霉素：烟台第二制药厂生产，干品607μ／mg，批号：990527。诺氟沙星：浙江新昌制药股份有限公司，含量为99．17%，批号：20000306。恩诺沙星：新昌原料药厂生产纯度为97．94%，批号：20000105。阿莫西林：为河北制药（集团）有限公司，含量为99．36%，批号：990426。强力霉素：购自中国兽医药品监察所，含量为99．7%，批号：990319。

1．2 方法

1．2．1 病原性大肠杆菌的分离与鉴定 无菌操作将患有典型大肠杆菌病症状患畜的心、肝、血等病料或以无菌棉拭子从直肠中采样，接种伊红美蓝、麦康凯琼脂培养基上，37℃培养过夜，挑取单个典型菌落接种普通琼脂培养基和普通肉汤培养基，进一步做三糖铁试验，选择反应模式符合大肠杆菌特征的三糖铁斜面进行涂片、染色、镜检。将疑为大肠杆菌的菌落进行斜面划线，冷藏保存，以备进行生化鉴定和体外抑菌试验。

将符合三糖铁斜面反应模式的细菌染色镜检为革兰阴性、两端钝圆、大多数单在的无芽孢短杆菌，进一步进行生化反应鉴定，将能够发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖均产酸产气，靛基质试验、甲基红试验阳性，V－P试验、枸橼酸盐利用试验为阴性者鉴定为大肠杆菌。

1．2．2 多重耐药大肠杆菌的筛选 取鉴定后的纯培养物接种于4mL的营养肉汤中，37℃培养16h后，取一定量的菌液，按常规方法进行菌液的活菌计数，剩余菌液在4℃保存。

采用药敏纸片法按世界卫生组织（WHO）推荐的Kirby－Bauer氏法进行。将纯培养菌制成悬液，稀释后菌液浓度为麦氏管的0．5号管（菌液浓度为106～107CFU／mL），均匀涂布0．1mL稀释后菌液的营养琼脂平板上中间铺放好药敏纸片，37℃培养16h，测定抑菌环直径，每次设药敏质控株ATCC25922为对照菌，根据上述标准判定大肠杆菌是否对抗菌药物耐药，从中挑选出多重耐药大肠杆菌供进一步研究用。

采用平皿二倍稀释法测定各菌株对上述6种药品的最低抑菌浓度（MIC），结果按美国临床检验标准委员会（NCCLS）的标准判断。

2 结果

2．1 镜检与生化鉴定结果 于2010年8月至2012年5月从沈阳、锦州、葫芦岛、阜新、抚顺地区共分离出64株动物源性大肠杆菌，其中，禽大肠杆菌28株，猪大肠杆菌31株，犬大肠杆菌4株，狐狸大肠杆菌1株。

2．2 64株大肠杆菌的耐药谱 从辽宁省5个地区分离出大肠杆菌64株，经对12种抗菌药物的耐药性普查结果表明（图1）：64株受检菌株全部对一种或多种抗菌药物有耐药性，无一全部敏感株。单耐药株占1．56%（1／64），2～4耐药株占9．38%（6／64），5～7耐药株占15．63%（10／64），8～10耐药株占12．5%（8／64）。64株大肠杆菌中，共有30种以上的耐药谱型，大多数为多重耐药株，最普遍的耐药类型是：TE，SXT，SMX、S、AM、CIP、NOR、OFL、GM，它们占受检菌株的50%。

2．3 64株大肠杆菌药敏试验结果 12种抗菌药物中，抑菌作用最强的是CX，敏感菌株占81．25%、SPT（78．13%）、TM（67．19%）；而 SMX、SXT、TE等药物则表现出很高的耐药性，耐药菌株分别占SMX（89．06%）、TE（87．5%）、SXT（84．38%）、CB（78．13%）、S（70．31%），此 外，OFL（65．63%）、NOR（62．5%）、CIP（59．38%）、GM（50%）的耐药株已十分普遍（见表1）。

2．4 随机挑选20株大肠杆菌对6种抗菌药物的最低抑菌浓度测定的结果 临床分离动物源性大肠杆菌对6种抗菌药物的耐药程度十分严重。对硫酸庆大霉素，最低抑菌浓度为敏感株的10倍以上耐药株已占58．5%；对氯霉素、氟哌酸、恩诺沙星、阿莫西林、强力霉素最低抑菌浓度为敏感株的数十倍的耐药株分别占32．5%、45．5%、56．5%、62．5%、60．5% 。

图1 64株动物源性大肠杆菌耐药谱

表1 64株动物源性大肠杆菌药敏试验

2．5 多重耐药株的筛选 选择多重耐药大肠杆菌7株，供进一步研究用。选择的多重耐药株对上述6种药物的最小抑菌浓度（MIC）见表2。其中1号菌为H10407敏感株，9号菌为药敏质控株，2，3，号菌为猪源性大肠杆菌4，5，6号菌为鸡源性大肠杆菌，7号菌为犬源性大肠杆菌，8号菌为狐狸源性大肠杆菌。

3 讨论

采用kirby－Bauer法，同时以质控标准菌株做对照，从辽宁省5个地区分离的64株大肠杆菌所做的对12种抗菌药物的药敏试验结果表明，64株大肠杆菌均表现出不同程度的耐药，在这些耐药株中，单耐药株为1株，6耐、7耐、10耐菌株居多，分别为5．87%、7．98%、5．88%，说明动物源性大肠杆菌的耐药性以多重耐药为主，不再停留在对同一类中数种抗菌药物的交叉耐药。对随机抽取的20株动物源性大肠杆菌对6种抗菌药物的最低抑菌浓度测定的结果表明，耐药程度已经相当严重。临床分离的大肠杆菌对硫酸庆大霉素、恩诺沙星、阿莫西林、强力霉素的最低抑菌浓度为敏感株数10倍以上的菌株已超过半数。

表2 7株动物源性大肠杆菌对6种抗菌药物最低抑菌浓度 （MICμg／mL）值

多重耐药株的大量出现，可能与耐药性质粒［2］、菌体细胞膜通透性，菌体上存在的主动外排系统有关［3－5］。菌体细胞膜通透性的改变仅能引起低程度的耐药，多重耐药主要与存在于膜上的主动外排系统有关，菌体细胞膜通透性的改变与主动外排系统的超量表达共同作用可引起细菌对多种抗菌药物高频率高水平耐药，耐药性质粒的存在可使多重耐药水平提高数倍。大肠杆菌膜上存在Ecr、EmrE、EmrAB、EmrD、QacE、AcrAB、AcrEF等主动外排系统。其中染色体DNA上的AcrAB基因编码的AcrAB蛋白是最主要的主动外排系统，可完成多种药物的外输，如果使该系统失活，则菌株即从多重耐药状态变为相对敏感状态。多重耐药性的产生是由于外输泵转录增加或相应的mRNA稳定性增加所致。AcrAB基因的转录水平增加相应的mRNA稳定性增加引起的多重耐药程度和范围尚待进一步研究。

临床应用较多的庆大霉素、链霉素、复方新诺明、氟哌酸等的耐药株已显著增加，只有极少使用的头孢氨苄对大肠杆菌的抑制作用强，因而，应尽量避免使用临床应用较多的药物，一方面影响临床治疗效果，另一方面促进耐药因素的扩散。

［1］ 王晶钰，于艳荣，张彦明，等．鸡源大肠杆菌某些生物学特性与致病力相关特性的研究［J］．中国家禽，1999，11（6）：5－10．

［2］ 赵静，杨汉春，查振林．规模化猪场大肠杆菌耐药性监测 ［J］．中国兽医杂志，1998，24（11）：12－13．

［3］ 张小林，李家泰．主动外排系统在大肠杆菌中的分布与表达［J］．中国临床药理学杂志，1999，15（3）：171－174．

［4］ Martin J，Everett，Yu Fang Jin，etal．J V Piddock Conrtribution of Individual Mechanisms to Fluoroquinolone Resistance in 36Escherichia coli Strains Isolatated from Humans and Animals［J］．Antimicrob Agents Chemother，1996，40：2380－2385．

［5］ John D，Goldman，David G，etal．Multiple Antibiotic Resisrance（mar）Locus Protects Escherichia coli from Rapid Cell Killing by Fluoroquinolones［J］．Antimicrob Agents Chemother，1996．40：1266－1268．