冬凌草甲素抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖及诱导细胞凋亡的机制研究

邓志成， 陈 胜， 刘双海

冬凌草甲素(oridonin)是我国自行研制的一种抗肿瘤药物，是从唇形香茶属植物冬凌草中提取的一种以贝壳杉烯为骨架的四环二萜类化合物。已有研究证实冬凌草甲素对肺癌、前列腺癌、乳腺癌等多种细胞株均具有明显的体外抑制作用［1］，也有研究证实，冬凌草甲素对多种移植性肿瘤具有明显的抑制作用，其对实体瘤的治疗作用目前也已广泛地应用于临床，常用于食管癌、胃癌等肿瘤的治疗，且已取得明显的临床疗效［2-3］。为了探讨冬凌草甲素在肝癌中的疗效及其作用机制，本研究以人肝癌细胞株SMMC-7721为研究对象，通过检测Survivin、Bcl-2、Bax蛋白和 Survivin、Bcl-2、Bax mRNA 表达的变化，观察不同浓度的冬凌草甲素对人肝癌SMMC-7721细胞的生长抑制及诱导凋亡作用，探讨冬凌草甲素对人肝癌SMMC-7721细胞的生长抑制及诱导凋亡机制，为冬凌草甲素应用于临床治疗肝癌提供有力的实验依据。

1 实验材料

细胞株为人肝癌SMMC-7721，购自中国科学院上海细胞库;冬凌草甲素购自南京泽朗生物科技有限公司;RPMI 1640培养基购于赛默飞世尔生物化学制品有限公司;10%新生小牛血清购于杭州四季青生物工程研究所;四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂、逆转录试剂盒购于美国Sigma公司;鼠抗人Bcl-2、Bax、Survivin单抗购于碧云天生物技术研究所。Air Tech超净实验台(苏州净化设备仪器厂);BB5060型CO2孵育箱(德国Heraeus);倒置显微镜(OLYMPUS公司);紫外分光光度计(美国Beckman Coulter公司);酶联免疫检测仪(华东电子集团医疗设备装备有限公司);凝胶成像系统(美国Viber Lourmat);9600型PCR扩增仪(美国 ABI公司);power PAC 2000型蛋白核酸定量仪(美国Bio-Rad公司)。

2 实验方法

2.1 细胞培养 SMMC-7721细胞株复苏后悬浮生长于RPMI 1640培养液中，内含10%小牛血清、1 mmol/L谷胺酰胺及青、链霉素各100 U/L。于37℃、5%CO2饱和湿度的孵箱中培养，每2～3 d传代1次，取对数生长期的细胞接种于含冬凌草甲素浓度分别为 5、10、20、30、40 μmol/L 的培养体系中进行实验，将细胞终浓度调至2×105/L。

2.2 MTT法检测细胞生存率 取对数生长期的人肝癌 SMMC-7721 细胞，0.25% 胰酶(含 0.02%EDTA)消化后，用1640培养液制成单细胞悬液，以每孔2×105个细胞接种于96孔培养板中，每孔100 μL，于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养，待24 h细胞完全贴壁后，更换新的培养基，分别加入含冬凌草甲素浓度为 5、10、20、30、40 μmol/L，共同培养12、24、48、60、72 h 并设立加培养基不加药物的阴性对照组，每组各设6个复孔，同时设调零孔(空白培养基、MTT、DMSO)，继续在 37℃、5%CO2培养箱内培养，分别在加药后的 12、24、48、60、72 h 时取出培养板，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)10 μL，37℃孵育4 h后，阴性对照组中已形成明显的蓝紫色颗粒结晶时，弃去孔内培养液，每孔加入 150 μL DMSO，将培养板放在平板摇床上振荡10 min，使结晶充分溶解，在酶联免疫检测仪检测570 nm波长处的每孔吸光度值(A值)，算出各药物浓度6个复孔的平均值，根据公式:抑制率=(1－实验组平均A值/对照组平均A值)×100%，计算不同浓度、时间下冬凌草甲素对人肝癌SMMC-7721细胞生长的抑制率，平均抑制数据以x±s表示，以Excel软件绘制曲线。

2.3 细胞形态学观察 按培养条件，将人肝癌SMMC-7721细胞接种于六孔培养板内，待细胞贴壁良好，处于对数生长期时，分别以不同浓度冬凌草甲素作用48 h后，用倒置显微镜观察细胞形态学变化。

2.4 RT-PCR 半定量检测 Survivin、Bcl-2、Bax mRNA的表达 提取10、20、30、40 μmol/L 浓度组冬凌草甲素及对照组作用48 h后的SMMC-7721细胞2 μg总RNA反转录为cDNA，等量取cDNA，用相对应的引物对基因片段进行扩增。根据目的基因序列设计引物(表1)，引物由上海生工有限公司合成并经质量检测，开盖前瞬时离心，加入TE(pH 8.0)稀释至浓度为10 μM，－20℃储存备用，PCR循环程序:GAPDH变性94℃，1 min，退火温度53℃，2 min，延伸 72 ℃，3 min，循环次数 30;Survivin和Bcl-2变性94℃，45 s，退火温度61℃，时间1 min，延伸72℃，1 min，循环次数40;Bax变性94℃，45 s，退火温度 58℃，时间 1 min，延伸72 ℃，1 min，循环次数40;10 min结束反应。取5 μL PCR产物与1 μL 6×上样缓冲液混合，上样于1.5%琼脂糖凝胶，以电压100 V，在 1×TAE缓冲液中电泳30 min分离片段。所有RT-PCR均进行3次。试验电泳后凝胶条带经Genesnap成像后用Genetool行半定量分析，结果用各个基因扩增条带的灰度值与内参照GAPDH的灰度值的比值表示。

表1 引物序列及扩增片段

2.5 Western Blot法检测 Survivin、Bax、Bcl-2 的蛋白水平 给予10、20、30、40 μmol/L冬凌草甲素作用48 h后离心收集细胞，预冷的PBS洗2次，按5×105个细胞加入50～60 μL裂解液的比例加入细胞裂解液，超声细胞破碎仪低温超声裂解细胞，4℃、10 000 rpm离心10 min，分装上清，－70℃保存，用10%SDS-PAGE分离，转到偏聚氟二乙烯PVDF膜上，加入1∶1 000单抗2 h后 PBS和 TBST各洗2次，1∶1 000辣根过氧化物酶标记的二抗IgG孵育1 h，TBST洗2次，应用ECL Western Blotting检测系统测定，实验重复3次。

2.6 统计学处理 所有数据以x±s及百分率(%)表示，使用SPSS16.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析(ANOVA)、SNK两两比较法，以 P＜0.05为具有统计学意义。

3 实验结果

3.1 MTT比色法测定冬凌草甲素对人肝癌SMMC-7721细胞的抑制作用 不同浓度的冬凌草甲素(10、20、30、40 μmol/L) 均可抑制人 肝 癌细胞SMMC-7721细胞生长，且随浓度升高和作用时间延长，作用逐渐增强;40 μmol/L冬凌草甲素引起的生长抑制率明显高于其他浓度组的抑制率，5 μmol/L冬凌草甲素对细胞的增长无明显抑制作用(P＞0.05)，其他各实验组与对照组比较均有统计学意义(P ＜0.05)。不同时间组(12、24、48、60、72 h)间的差异也有统计学意义(P＜0.05)。通过测量吸光度值计算细胞生长抑制率并绘制生长抑制曲线图(图1)。

3.2 细胞形态学变化 药物作用后细胞的体积、形态及细胞内的结构均发生了明显的变化，随着作用时间的延长，细胞的死亡数量增加，显微镜下可见大量的细胞碎片。部分细胞核内染色质开始浓缩并逐渐形成块状，有些染色质块聚集在核膜边缘或贴近核膜，随着药物作用时间的延长，染色质逐渐发生断裂，部分核膜逐渐崩解，染色质呈分叶状或形成粗细不均匀的碎块并相互分离，不均匀地分散于细胞浆中，有些细胞的胞浆中出现空泡，40 μmol/L浓度组可见大量凋亡细胞皱缩，体积缩小，密度增高(图2)。

图1 细胞生长抑制率的变化

图2 光镜下冬凌甲素不同浓度组细胞生长情况(×200)

结果可见，冬凌草甲素作用48 h后5 μmol/L冬凌草甲素发生细胞凋亡细胞较少，而10、20、30、40 μmol/L冬凌草甲素作用48 h后，细胞出现典型的凋亡改变，凋亡细胞可达50% ～60%，而且凋亡细胞的数量随着药物浓度的升高而增加;凋亡细胞主要表现为细胞核浓缩及细胞核碎裂。

3.3 冬凌草甲素对人肝癌SMMC-7721细胞Survivin、Bcl-2、Bax mRNA表达的影响 通过RT-PCR检测发现，10、20、30、40 μmol/L 冬凌草甲素作用 48 h后，Bax mRNA的表达随药物浓度的增加而表达增加，Bcl-2和Survivin mRNA的表达随药物浓度的增加而表达降低，呈现一定的剂量依赖性(图3)，说明冬凌草甲素能增加Bax mRNA的表达，抑制Bcl-2和Survivin mRNA的表达，且具有一定的量效关系。

图3 不同浓度冬凌草甲素对SMMC－7721细胞Bcl-2、Survivin、Bax mRNA表达的影响

3.4 冬凌草甲素对SMMC-7721细胞Survivin、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响 采用Survivin、Bax、Bcl-2抗体进行Western Blot分析，结果发现人肝癌SMMC-7721细胞经各药物组干预48 h后，Survivin和Bcl-2的表达呈下降趋势，条带变淡，Bax的表达成上升趋势，条带变深，呈现一定的量效关系(图4)。

图4 不同浓度冬凌草甲素对SMMC-7721细胞Survivin、Bax、Bcl-2 蛋白表达的影响

4 讨论

冬凌草甲素是从冬凌草中提取出来的一种四环二萜类化合物，其活性成分和药理作用机制比较复杂。目前多项研究［3-5］证实，冬凌草甲素对多种移植性肿瘤具有明显的抑制作用，可能机制为:(1)抗突变作用;(2)降低肿瘤细胞的钠泵转运活性;(3)增强其他抗肿瘤药物的疗效。目前还鲜有关于冬凌草甲素对人肝癌细胞的生长抑制及诱导凋亡作用机制的报道。

抗凋亡因子Survivin是凋亡抑制基因家族(IAP)的一个特殊成员，参与影响诸如凋亡、有丝分裂、血管生成、应激反应等生物过程在内的信号通路，Survivin的表达受细胞周期的严格调控，当细胞进入G2/M期时，Survivin表达极度上调;开始进入G1期时，其表达水平又迅速下降。Survivin基因选择性地在胚胎组织和大多数人类肿瘤中丰富表达，而在相应的正常成人组织中，其表达水平很低或完全无表达，这种表达的特异性，使得其成为近年来肿瘤基因治疗研究中的热门靶点。Bcl-2是一个重要的凋亡抑制基因，其包含一种能阻止细胞凋亡的核分子，延长细胞的生命，加速DNA的修复，因此可以促进肿瘤的生长和进展［6］。有报道认为中药可以诱导肿瘤的凋亡，且与抑制Bcl-2的表达有关［7-8］。Bax是Bcl-2家族中研究最广泛的促凋亡蛋白，Bax定位于细胞浆，自身可形成同源二聚体或与Bcl-2形成异源二聚体。当细胞内Bcl-2较多时，Bcl-2和Bax的异源二聚体增多，凋亡趋势减弱;当细胞内Bax较多时，则Bax本身形成的同源二聚体占主导，则易发生凋亡，Bcl-2/Bax的比值对决定细胞是否进入凋亡状态有重要意义。Survivin和Bcl-2可通过不同的途径控制细胞的凋亡，两者的联合表达是癌症中一个重要的预后参数和治疗靶点。

本研究采用MTT法和流式细胞术观察冬凌草甲素对体外培养的人肝癌SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响。结果显示，浓度＞10 μmol/L的冬凌草甲素对人肝癌SMMC-7721细胞生长有明显的抑制作用，呈一定的时间和剂量依赖关系;且先前的预试验也证明，当浓度＞40 μmol/L时，冬凌草甲素对肝癌细胞的生长抑制作用进入平台期。这说明诱导细胞凋亡可能是冬凌草甲素抑制人肝癌SMMC-7721细胞体外生长的机制之一。为进一步论证冬凌草甲素诱导肿瘤细胞凋亡的机制，我们检测了不同浓度的冬凌草甲素分别作用于人肝癌SMMC-7721细胞48 h后的Survivin、Bcl-2、Bax mRNA 和蛋白的表达情况，发现人肝癌SMMC-7721细胞 Bax mRNA和蛋白随冬凌草甲素浓度增加而表达增加，Bcl-2、Survivin mRNA和蛋白随药物浓度增加表达下降，表明冬凌草甲素可作为治疗肝癌的有效药物，但其是否能广泛应用于临床还有待进一步的验证。

［1］ 冯长伟，潘祥林，钟丽红，等.冬凌草甲素的提取分离［J］.山东中医药大学学报，1999，23(6):461-462.

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［3］ Yang SL，Han SY，Zhang Q，et al.Study on the antimution of oridonin［J］.Carcinog Teratog Mutag，2001，13(1):8-10.

［4］ Suzuki A，Ito T，Kawano H，et al.Survivin initiates procaspase3/P21 complex fomation as a result of interaction with CDK4 to resist Fasm idiated cell death［J］.Oncogene，2000，19(10):1346-1353.

［5］ Adida C，Haioun C，Salles G，et al.Prognostic significance of survivin expression in diffuse large B cell lymphomas［J］.Blood，2000，96(5):1921-1925.

［6］ Green DR，Reed JC.Mitochondria and apoptosis［J］.Science，1998，281(5381):1309-1312.

［7］ 张学武，崔长旭，陈丽艳.珍珠梅提取物抑制肝癌HepG-2细胞增殖的实验研究［J］.中药材，2007，30(6):681-684.

［8］ 刘嘉，曾庆琪.中药活性成分逆转肿瘤多药耐药的研究进展［J］.中医药信息，2011，28(5):112-114.