南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L RNA解旋酶CiDDX5的基因特征及其表达分析＊

宓妍妍，王 燕，黄晓航，刘晨临＊

（1.山东轻工业学院 食品与生物工程学院，山东 济南250353；2.国家海洋局 第一海洋研究所，山东 青岛266061）

DEAD-box RNA解旋酶能介导NTP依赖的双链RNA解旋，利用ATP依赖的RNA酶催化RNA二级结构的构象变化，在许多RNA参与的代谢活动中发挥关键作用。DEAD-box RNA解旋酶参与RNA转录、前体mRNA剪切、核糖体发生、核质运输、蛋白质翻译和RNA降解等重要的生命活动，广泛存在于从病毒到人类几乎所有已知的生命形式中［1］。

越来越多的研究表明，DEAD-box RNA解旋酶参与植物细胞中的各种代谢过程，具有广泛的生理意义，并且在对逆境的适应中具有重要作用［2］。2000年，Chamot等［3］在蓝藻中发现了一些冷诱导的基因，RNA解旋酶基因就是其中之一［4-7］。除温度以外，RNA解旋酶基因还受光照、氧气和渗透压等条件变化的影响［8］。2005年，在拟南芥中发现1个DEAD-box RNA解旋酶基因发生突变，这个DEAD-box RNA解旋酶与m RNA输出、植物发育和逆境反应有关系［9］。集胞藻PCC6803只有1个RNA解旋酶基因，即crh R（sir0083），它的表达也受低温诱导，还在一定程度上受组氨酸激酶基因hik33的影响［2，7］。研究表明，crh R突变使groES，groEL1和groEL2分子伴侣基因的转录不受低温诱导上调表达［8］。RNA解旋酶可能直接或间接地影响某些酶或蛋白质的合成，因而在生物的逆境适应过程中发挥作用。

本研究从南极分离到一株严格嗜冷的海冰衣藻Chlamydomonas sp.ICE-L，严酷的极地生境造就了生活在海冰环境中的真核光合微藻（冰藻）独特的生物学特性。在南极海冰的形成、生长和融化的季节性变化中，冰藻也经受了温度、光照等生态条件的剧烈变化。温度和盐度是影响海冰中冰藻种类生存的主要因素，Chlamy domonas sp.ICE-L对低温、高盐等逆境具有很强的适应能力。实验室培养发现，受正常海水3倍的盐度变化，其最适生长温度为4～10℃。目前对DEAD-box RNA解旋酶基因的研究主要集中在人类，以及玉米，水稻，蓝藻和集胞藻等植物方面，对于极地浮游植物的研究还很少。

本研究通过对筛选到的1条南极冰藻DEAD-box RNA解旋酶CiDDX5基因进行生物信息学分析，并研究其在低温、高盐环境中表达量的变化，探寻DEAD-box RNA解旋酶基因的功能，为揭示南极冰藻在低温、高盐环境中的适应机制提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L分离自由中国极地研究所（上海）提供的南极中山站（69°S，77°E）附近的浮冰中。采用Provasoli培养基培养，培养条件为：温度7℃，光照强度1 300～1 600 lx，光照周期12 h／12 h L／D。南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L的RNA解旋酶基因序列来自于本实验室构建的南极衣藻Chlamydomonas sp.ICE-L EST文库，测序由上海桑尼生物技术有限公司完成。

1.2 DEAD-box RNA解旋酶基因的生物信息学分析

DEAD-box RNA解旋酶CiDDX5基因的开放阅读框（open reading frame，ORF）分析通过NCBI网站（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov）进行，用DNAStar软件包中的EditSeq软件预测蛋白的理论分子量和等电点。通过 SWISS-MODEL［10-12］（http：／／swissmodel.expasy.org／）网站预测 RNA 解旋酶基因的三级结构。

将测定的CiDDX5基因序列用BLAST软件与GenBank（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov）中已知的其他RNA解旋酶基因序列进行比对。选取相似性较高的序列［13］用BioEdit软件进行对位排列，人工校正和合并序列。用MEGA 4.0［14］软件分析中的紧邻法（neighbor-joining method，NJ）推测系统关系，构建系统发育树，通过自展检测法（bootstrap test）估计所构建的系统发育树的可靠性，重复次数为1 000次。

运用DNAStar软件将Chlamydomonas sp.ICE-L的CiDDX5基因和其它3个遗传距离较近的绿藻DEAD-box RNA解旋酶基因进行氨基酸序列同源性分析。

1.3 CiDDX5基因定量表达分析

1.3.1 样品处理

低温胁迫处理，在-20℃避光条件下，将7℃培养的对数期南极冰藻Chlamy domonas sp.ICE-L样品分别处理0.5，1，3，6和12 h。以7℃避光处理0 h和12 h的混合样品作为对照。

高盐胁迫处理，将正常海水盐度（33）培养的对数期南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L样品浓缩后置于3倍海水盐度（99）的培养基中，正常光照条件下分别处理0.5，1，3，6和12 h，以正常盐度海水培养0 h和12 h的混合样品作为对照。

样品离心收集，液氮迅速冷冻后放入-80℃冰箱保存。分别用液氮研磨后立即进行RNA提取。

1.3.2 RNA提取

采用CTAB法［15］提取南极冰藻ICE-L的总RNA：1）将研磨好的藻样加到600μL CTAB裂解液（2 g CTAB，1 g PVP，0.585 g EDTA，8.182 g NaCl，100 m L DEPC处理水）中，60℃水浴10 min；2）加入等体积的氯仿-异戊醇（24：1，V／V），抽提两次，4℃，13 000 rpm离心10 min；3）加入1／4体积10 mol／L的LiCl溶液，-20℃沉淀2～3 h；4）用75%乙醇洗涤沉淀两次，加入30μL DEPC处理水溶解沉淀；5）用琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA的质量并用紫外分光光度计检测所提RNA的浓度和OD260／OD280。

提取出的RNA用全式金反转录试剂盒（北京全式金生物科技有限公司）进行反转录，用于实时定量PCR。

1.3.3 实时定量PCR

根据南极冰藻ICE-L的CiDDX5基因序列，利用Primer 5.0软件设计所需特异性引物，并由北京市理化分析测试中心代为合成。选择磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH和核糖体蛋白RLP19这两对基因作为本次实验的参比基因，引物序列见表1。

在荧光定量PCR仪（Mx3000，美国Stratagene公司）上进行扩增和数据分析。反应体系为10μL，反应程序：95℃5 min；95℃10 s，63℃20 s，72℃20 s，40个循环；循环后升温至95℃，再降至63℃，以0.5℃递增至95℃。

将实验重复3次。数值取3次重复的平均±SE，通过2-ΔΔCt方法［16］计算低温和高盐条件下不同诱导时间对ICE-L的CiDDX5基因表达的影响。

表1 实时定量PCR引物Table 1 The primers of Real-Time PCR

2 结果与分析

2.1 CiDDX5基因的序列分析

测序分析表明，CiDDX5基因全长为2 077 bp，含有1个完整的开放阅读框，编码513个氨基酸。预测该基因编码的蛋白的理论分子量为74.5 k Da，等电点为9.14。

将预测的CiDDX5氨基酸序列进行Protein Blast分析发现其含有DEAD-box解旋酶的保守结构域和解旋酶超家族C端的保守结构域（图1）。

图1 Blast分析CiDDX5基因可能含有的功能域DEADc：DEAD-box解旋酶的保守结构域；HELICc：解旋酶超家族C端的保守结构域Fig.1 Potential functional domains of the CiDDX5 gene by Blast analysis DEADc：DEAD-box helicase domain；HELICc：Helicase superfamily C-terminal domain

2.2 CiDDX5基因的蛋白质三级结构预测分析

将ICE-L的CiDDX5的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL预测分析，发现其与数据库中，来自人类的2种解旋酶Ddx5（P68）和Ddx3x的功能蛋白相似度最高。分别达到49%和41%，具有同源模建的意义。表2中a和b两个肽段的功能分别为镁辅因子和ATP结合位点。

表2 预测CiDDX5所含两个肽段的信息Table 2 The information of two predicted peptides of the CiDDX5

2.3 CiDDX5氨基酸序列的系统发育分析

从构建的CiDDX5序列的系统发育树可以看出，绿藻、高等植物和真菌分别构成了3个独立的分支，CiDDX5蛋白序列与莱茵衣藻，团藻和胶球藻等绿藻的相关序列聚类在一起，说明CiDDX5的蛋白结构与其所属物种的分类地位是相关的（图2）。

图2 CiDDX5序列的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of CiDDX5 sequence constructed by the neighbor joining method

2.4 CiDDX5氨基酸序列同源性分析

运用DNAStar软件将CiDDX5氨基酸序列和3种绿藻的氨基酸序列进行同源性比对，从分析结果可看出ICE-L与莱茵衣藻，团藻和胶球藻的同源性较高，分别为66%，65%和64%。将ICE-L的CiDDX5的氨基酸序列与其它3种单细胞绿藻的RNA解旋酶蛋白序列进行比对，发现其编码DEAD-box RNA解旋酶特有的9个保守的氨基酸基序（图3），说明CiDDX5属于DEAD-box RNA解旋酶。但是，CiDDX5蛋白中的保守氨基酸基序与其它绿藻的DEAD-box RNA解旋酶的保守序列不完全一致。在所有9个保守基序中Motif Q的保守性最差，4种不同绿藻的Motif Q均有不同组成的氨基酸。CiDDX5的保守基序MotifⅧ是YIHRLGRTGR，其它绿藻的均为YVHRIGR。

图3 ICE-L CiDDX5和3种不同DEAD-box RNA解旋酶氨基酸序列同源性分析Fig.3 Amino acid sequence comparison ICE-L CiDDX5 and other representative DEAD-box RNA helicases.

2.5 CiDDX5基因定量表达分析

在-20℃冰冻胁迫条件下，南极冰藻经不同时间的处理过程后，CiDDX5基因的表达量发生了明显的变化（图4）。随着处理时间的延续，该基因的表达量逐渐升高，处理3 h时，CiDDX5基因的相对表达量达到最大值，此时表达量为未经低温处理组的1.8倍，之后开始降低；在处理12 h后，CiDDX5基因的相对表达量降为对照组的一半。

图4 -20℃ 低温胁迫下CiDDX5基因的定量表达Fig.4 The quantitative expression of the CiDDX5 gene under low temperature stress of-20℃

检测经过3倍盐度培养处理的冰藻CiDDX5基因表达量的变化，其实时定量PCR的结果见图5。在高盐胁迫下CiDDX5基因的表达量持续升高，在6 h处理后表达量达到最大值，为对照组的2.9倍，在12 h略有降低。在所选取的处理时间段内，处理组基因的表达量都是高于对照组。表明在高盐胁迫下，CiDDX5基因的表达量较低温处理条件下发生了更为明显和持久的变化，提示该基因在冰藻应对高盐胁迫方面可能发挥更重要的作用。

图5 3倍盐度胁迫下ICE-L DEAD-box RNA解旋酶基因的定量表达Fig.5 The quantitative expression of the CiDDX5 gene under salinity stress of 3 times

3 讨 论

越来越多的研究表明，植物中RNA解旋酶的表达受到各种生物和非生物胁迫的影响［2，8，15-16］。在本研究中，克隆得到了南极冰藻Chlamydomnas sp.ICE-L的RNA解旋酶CiDDX5基因，进行了生物信息学分析，并研究了冰藻的该基因在低温和高盐胁迫下表达量的变化。

解旋酶是存在于原核生物和真核生物中的一个庞大蛋白类群，分为5个（超）家族，即SF1～5。DEAD-box RNA解旋酶属于SF2家族成员［2］，根据保守的DEAD模体的序列差异分为DEAD，DEAH，DECH和DEVH类群，这些类群的蛋白中均包含特征性的保守基序结构［2］。CiDDX5蛋白中包含了所有9个保守性模体结构，因而可以推定它是DEAD-box RNA解旋酶蛋白。DEAD-box RNA解旋酶蛋白中的保守基序与其生化功能有密切关系，其中Motif V和MotifⅧ共同参与ATP的水解，而模体Ⅵ则与RNA的解链有关。CiDDX5中的模体V为DEAD，而模体Ⅵ为SAT，这与DEAD类群的DEAD-box RNA解旋酶蛋白中的模体序列相一致。

在植物中DEAD-box RNA解旋酶的表达受到生物以及非生物条件的影响。在低温胁迫下Av DH1和STRS1的表达可能在早期调节机制中发挥作用；而在高盐胁迫下上述两基因的表达可能起到长期调节的作用［17-18］。从本研究中可以看出，低温胁迫下CiDDX5基因的表达量在处理3 h时达到了最大值；而在高盐胁迫下，在处理12 h时基因仍具有很高的表达量。以上研究结果与Liu等［19］在高等植物中所做的研究结果相一致。

Gong等［20］发现在冷胁迫的条件下，DEAD-box RNA酶缺陷型的植物中，mRNA在从细胞核输出到细胞质的过程中受损。Zhu等［21］研究结果表明，RNA代谢过程的调节对于植物的低温适应是非常重要的，DEAD-box RNA解旋酶在生理调节方面的重要作用。蓝藻中DEAD-box RNA解旋酶的有关研究表明，crh R编码的RNA解旋酶可能通过改变mRNA的构象，影响其在低温下的稳定性，从而调节某些基因的表达水平；这种对二级构象的调节可能是某些mRNA在低温下指导蛋白合成所需要的。对拟南芥的相关研究表明，低温胁迫下At RH25和At RH9两种RNA解旋酶的表达都会发生上调。本研究初步揭示了CiDDX5在南极冰藻低温、高盐环境胁迫下表达量的变化，分析了其可能的分子作用机制。在今后的研究里，还需要进一步对其是否是ATP依赖型、其受到胁迫的信号调节分子是什么，以及其靶向作用的m RNA的类型等方面进行更为深入的研究，以期加深对南极冰藻RNA解旋酶的了解，进一步揭示南极冰藻在极端环境条件下的适应机制。

：

［1］ HALL M C，MATSON S W.Heliease motifs：the engine that powers DNA unwinding［J］.Molecular Microbiology，1999，24（5）：867-877.

［2］ VASHISHT A A，TUTEJA N.Stress responsive DEAD-box helieases：a new pathway to ngineer plant stress tolerance［J］.Journal of Photochemistry and Photobiology.B，Biology，2006，84：150-160.

［3］ SUZUKI I，KANESAKI M K，MIKAMI K，et al.Cold-regulated genes under control of the cold sensor Hik33 in Synechocystis［J］.Molecular Microbiology，2001，40（1）：235-244.

［4］ CHAMOT D，MAGEE W C，YU E，et al.A cold shock induced cyanobacterial RNA helicase［J］.Journal of Bacteriology，1999，181：1728-1732.

［5］ CHAMOT D，OWTTRIM G W.Regulation of cold shock-induced RNA helicase gene expression in the cyanobacterium Anabaena sp.strain PCC 7120［J］.Journal of Bacteriology，2000，182（2）：1251-1256.

［6］ VINNEMEIER J，HAGEMANN M.Identification of salt-regulated genes in the genome of the cyanobacterium Synechocystis sp.strain PCC 6803 by subtractive RNA hybridization［J］.Atchives of Microbiology，1999，172（6）：377-386.

［7］ MIKAMI K，KANESAKI Y，SUZUKI I，et al.The histidine kinase Hik33 perceives osmotic stress and cold stress in Synechocystis sp.PCC 6803［J］.Molecular Microbiology，2002，46（4）：905-915.

［8］ OWTTRIM G W.RNA helicases and abioti stress［J］.Nucleic Acids Research，2006，34（11）：3220-3230.

［9］ CHAMOT D，COLVIN K R，KUJAT-CHOY S L，et al.RNA structural rearrangement via unwinding and annealing by the cyanobacterial RNA helicase，CrhR［J］.The Journal of Biological Chemistry，2005，280：2036-2044.

［10］ ARNOLD K，BORDOLI L，KOPP J，et al.The SWISS MODEL Work space：A web based environment for protein structure homology modeling［J］.Bioinformatics，2006，22（2），195-201.

［11］ SCHWEDE T，KOPP J，GVEX N，et al.SWISS-MODEL：an automated protein homology-modeling server［J］.Nucleic Acids Research，2003，31（13）：3381-3385.

［12］ GUEX N，PEITSCH M C.SWISS-MODEL and the Swiss-Pdb Viewer：an environment for comparative protein modelling［J］.Electrophoresis，1997，18（15）：2714-2723.

［13］ SONG B，WARD B B.Molecular characterzation of the assimilatory nitrate reductase gene and its express in the marine green alga Dunaliella tertiolecta（Chlorophyceae）［J］.Journal of Phycology，2004，40（4），721-731.

［14］ KUMAR S，NEI M，DVDLEY J，et al.A biologistcentric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences［J］.Briefings in Bioinformatics，2008，9（4）：299-306.

［15］ EICKEN H，BOCK C，WITTIG R，et al.Magnetic resonance imagine of sea-ice pore fluids：methods and thermal evolution of pore microstructure［J］.Cold Regions Science and Technology，2000，31（3）：207-225.

［16］ LIVAK K J，SCHMITTIGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C［J］）method［J］.Methods，2001，25（4）：402-408.

［17］ LIU H H，LIU J，FAN S L，et al.Molecular cloning and characterization of a salinity stress-induced gene encoding DEAD-box helicase from the halophyte Apocynum venetum ［J］.Journal of Experimental Botany，2008，59（3）：633-644.

［18］ CHUNG E，CHO C H，YUN B M，et al.Molecular cloning and characterization of the soybean DEAD-box RNA helicase gene induced by low temperature and high salinity stress［J］.Gene，2009，443（1-2）：91-99.

［19］ LI D，LIU H，ZHANG H，et al.OsBIRH1 a DEAD-box RNA helicase with functions in modulating defence responses against pathogen infection and oxidative stress［J］.Journal of Experimental Botany，2008，59（8）：2133-2146.

［20］ GONG Z，DONG C H，LEE H，et al.A DEAD-box RNA helicase is essential for mRNA export and important for development and stress responses in Arabidopsis［J］.The Plant Cell，2005，17（1）：256-267.

［21］ ZHU J，DONG C H，ZHU J K.Interplay between cold-responsive gene regulation，metabolism and RNA processing during plant cold acclimation.Curr.Opin［J］.Current Opinion in Plant Biology，2007，10（3）：290-295.