中药肝复康对四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠肝组织PⅠ3K/PKB信号通路和PDGFR-β表达的影响*

李 骢 周 情 姜妙娜 张彩华 贾玉杰

肝纤维化是各种原因所致的反复肝损伤在组织修复过程中的一种代偿反应，以细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的构成改变和过度沉积为病理学特征。肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）激活引起以胶原为主的ECM各成分合成增多，降解相对不足，过多沉积在肝内，引起肝纤维化[1～5]。血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）是目前已知多肽生长因子中对HSC作用最强的有丝分裂原，能够通过不同的信号转导通路强烈刺激HSC增殖和迁移[6，7]，其中PI3K/PKB信号转导途径在肝纤维化的发生中起着重要的作用[8]。该信号通路广泛参与细胞的存活、分化和迁移，以及抗凋亡信号的转导等活动[9～11]。中药肝复康被证实对肝纤维化具有防治作用[12，13]。本研究探讨了肝复康对四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠肝组织PI3K/PKB通路的影响。

材料与方法

一、实验动物和细胞 健康SD大鼠，雌雄不限，体重180～220克，清洁级，由本校动物实验中心提供。

二、药物及含药血清的制备 肝复康由柴胡、当归、黄芪、赤芍、白芍、丹参等组成，其无菌原液由本校中西医结合研究所按既定的工艺制备（1.95g/ml）。将肝复康按 4.16ml/只分别给大鼠灌胃7次，每次间隔 24小时，在第7次灌胃后，行下腔静脉取血，常规处理后即为药物血清。对照组以生理盐水代替药物，制备方法同上。

三、肝纤维化动物模型的制备 随机将大鼠分为正常对照组、模型组和肝复康治疗组。在造模时，皮下注射以橄榄油稀释的10%四氯化碳5ml.kg-1，每周两次，共12周。正常对照组以同样方法皮下注射生理盐水。其中肝复康治疗组于造模第9周后开始用肝复康（溶于10ml/kg生理盐水）312.5mg.kg-1.d-1灌胃至20周，而正常对照组和模型组则以等容量的生理盐水灌胃。于21周末处死动物，迅速取出肝组织，称取肝脏湿重，部分用10%甲醛固定后制备石蜡切片，常规HE染色，光镜下观察肝组织纤维化程度和炎症活动度，其余置-70℃冰箱保存备用。

四、大鼠肝组织PDGF受体（R）-β表达的检测 采用SP法，兔抗鼠PDGFR-β多克隆抗体（工作浓度1:200）购自北京博奥森生物技术有限公司。二步法免疫组化检测试剂PowerVision（PV-6001）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

五、肝组织PI3K和PKB1mRNA水平检测 采用RT-PCR法，用Trizol试剂分别提取肝组织和HSCs总RNA，应用Quant Reverse Transcriptase逆转录合成cDNA第一链。以适量cDNA为模板，以β-actin为内参照，PCR扩增肝组织PI3K和PKB1基因片段。引物由华大基因研究中心合成。引物及PCR反应条件详见表1、2。

六、统计学处理 应用 SPSS 13.0软件，所有数据均用±s表示，采用单因素方差分析，然后用LSD法进行两两比较。P<0.05为有统计学差异，P<0.01为有显著性统计学差异。

表1 引物序列

表2 PCR反应条件

结果

一、肝复康对大鼠肝组织PDGFR-β蛋白表达的影响 正常组大鼠肝组织PDGFR-β表达呈弱阳性，模型组大鼠可见肝组织细胞质和/或细胞膜PDGFR-β阳性细胞数量明显增多，主要见于门静脉、汇管区及纤维间隔等纤维化区域，在炎性细胞浸润聚集区也有表达。与模型组比，治疗组大鼠肝组织PDGFR-β阳性细胞数量明显减少。根据阳性物质光密度分析，模型组PDGFR-β的表达（0.386±0.04）显著高于正常组（0.323±0.04），差异有统计学意义（P<0.01）；治疗组 PDGFR-β 表达（0.340±0.01）较模型组明显下降，差异有统计学意义（P<0.01），而治疗组与正常对照组比，则无统计学差异（图1）。

图1 大鼠肝组织PDGFR-β表达情况（SP法，100～400×）

二、肝复康对肝组织PI3K和PKB1mRNA水平的影响 在正常大鼠肝组织能检测到低水平的PI3Km-RNA；模型组大鼠肝组织PI3KmRNA水平明显上调，与正常组比有显著性差异（P<0.01）；治疗组大鼠肝组织PI3KmRNA水平较模型组明显下调，也有显著性差异（P<0.01），但与正常对照组比则无统计学差异（P>0.05，图2，表3）。三组肝组织PKB1 mRNA水平有类似的变化（图3，表3）。

表3 各组大鼠肝组织PI3K和PKB1mRNA水平（±s）的变化

表3 各组大鼠肝组织PI3K和PKB1mRNA水平（±s）的变化

与模型组比，①P<0.01

?

图2 肝组织PⅠ3KmRNA水平变化

图3 肝组织PKB1 mRNA水平变化

讨论

肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化发展的中间环节。近年来，随着肝纤维化发病机制的逐渐阐明，人们改变了肝纤维化不可逆转的观点，阻断及逆转肝纤维化成为该领域研究的重大课题。

研究表明，间质细胞，尤其是HSC在肝纤维化的发生发展中起重要作用。在正常情况下，HSC处于静止状态，多种细胞因子和化学介质均可作用于该细胞，经不同的信号转导途径使其激活[14]，活化的HSC主要特征包括HSC增殖和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达[15]。激活的HSC通过自分泌和旁分泌合成大量的细胞外基质在肝内沉积，直接造成肝内细胞外基质的过度增生，从而导致肝纤维化。

研究表明，PDGF是目前已知多肽生长因子中对HSC作用最强的有丝分裂原。PDGF能够强烈刺激HSC增殖、迁移，促使其胶原的产生和沉积，在肝纤维化发生发展中起着非常重要的作用。PDGF具有三种形式的二聚体亚型，即PDGF-AA、PDGF-BB和PDGF-AB。PDGF必须与细胞膜上的相应受体结合后才能发挥其生物学效应。PDGFR分子由α（PDGFR-α）和β（PDGFR-β）两种亚单位组成，因此PDGFR也具有三种不同的二聚体亚型，即PDGFR-αα、PDGFR-ββ和PDGFR-αβ。研究证明在肝纤维化时HSC表面的PDGFR以β受体为主，与PDGF-BB具有较强的亲和力，故PDGF-BB和PDGFR-β在肝纤维化发生过程中的作用尤为突出[16，17]。已经证实在肝纤维化时PDGF-BB mRNA水平明显上调[18]。PDGF在HSCs内主要通过Ras/ERK途径、PI3K/PKB途径和JAK/STAT途径来介导对HSC的激活。越来越多的研究显示磷脂酰肌醇-3（PI3K）激酶信号转导途径在肝纤维化的发生中有着重要的作用。PI3K是一类特异性磷酸化肌醇磷脂3位羟基的激酶，是生长因子受体超家族信号转导过程中的重要成员。PKB则是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，因是病毒v-Akt的产物，故又称Akt。目前发现PKB有三种亚型，其中以PKB1对肝纤维化作用最为重要。

中药复方制剂具有多种药效成分协同作用，长期用于抗纤维化的防治研究，已取得了明显的临床效果[19]。已证实肝复康能对纤维化肝组织PI3K/PKB信号途径产生影响。体内实验结果显示，与模型组比，治疗组大鼠肝组织PDGFR-β阳性细胞数较模型组明显减少；肝组织PI3K和PKB1的表达较模型组明显下调。

PDGF可通过PI3K/PKB信号途径发挥作用，PDGF-BB与PDGFR-β结合后激活PI3K，从而使PI3K、PKB1和α-SMA mRNA水平上调。中药肝复康可干预PI3K/PKB途径，使PI3K、PKB1和α-SMA mRNA水平下降，并可明显抑制PDGFR-β的表达。本实验结果显示PI3K/PKB信号转导途径参与了肝纤维化的发生，而复方中药肝复康对肝纤维化有明确的治疗作用，其作用机制可能与其作用于PI3K/PKB信号转导途径并能减少PDGFR-β的表达有关，这将为肝纤维化的临床治疗提供新的思路和途径。

[1]Tang LX，He RH，Yang G，et al.Asiatic acid inhibits liver fibrosis by blocking TGF-beta/Smad signaling in vivo and in vitro.PLoS One，2012，7 （2）:e31350.doi:10.1371/journal.pone.0031350.

[2]Pana TL，Wanga PW，Leub YL，et al. Ⅰnhibitory effects of Scutellaria baicalensis extract on hepatic stellate cells through inducing G2/M cell cycle arrest and activating ERK-dependent apoptosis via Bax and caspase pathway.J Ethnopharmacol，2012，139:829–837.

[3]Tsutomu F，Bryan CF，Suguru Y，et al.Mouse model of carbon tetrachloride induced liver fibrosis:Histopathological changes and expression of CD133 and epidermal growth factor.BMC Gastroenterol，2010，10:79.

[4]吴文娟，杨妙芳，朱人敏.肝星状细胞活化的分子生物学机制研究进展.实用肝脏病杂志，2009，12（4）：308-311.

[5]Bovenkamp MVD，Groothuis GMM，Meijer DKF，et al.Liver brosis in vitro:Cell culture models and precision-cut liver slices.Toxicol in Vitro，2007，21:545-557.

[6]Francis JE，Scott L F，Fibrogenesis Ⅰ.New insight into hepatic stellate cell activation:the simple becomes complex.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2000，279（1）:G7-11.

[7]Carloni V，Pinzani M，Giusti S，et al.Tyrosine phosphorylation of focal adhesion kinase by PDGF is dependent on ras in hu－，2000，31（1）:131-140.

[8]Ⅰmanishi Y，Maeda N，Otogawa K，et a1.Herb medicine Ⅰnchinko-to（TJ-135）regulates PDGF-BB-dependent signaling pathways of hepatic stellate cells in primary culture and attenuates development of liver fibrosis induced by thioacetamide administration in rats.J Hepatol，2004，41（2）:242-250.

[9]Sotosis Y，Ward SG.Phosphoinositide 3-kinase:a key biochemical signal for cell migration in response to chemokines. Ⅰmmunol Rev，2000，177:217-235.

[10]Kruger GM，Morrison SJ.Brain repair by endogenous progenitors.Cell，2002，110（4）:399-402.

[11]Ⅰwai M，Sato K，Omori N，et al.Three steps of neural stem cells development in gerbil dentate gyrus after transient ischemia.J Cereb Blood Flow Metab，2002，22（4）:411-419.

[12]Xu TT，Jiang MN，Li C，et al.Effect of Chinese traditional compound，Gan-fu-kang，on CCl4-induced liver brosis in rats and its probable molecular mechanisms.Hepatol Res，2007，37:221-229.

[13]张彩华，姜妙娜，李寒姝，等.肝复康对肝纤维化大鼠肝组织NF-κB、MMP-2和 TⅠMP-2表达的影响.实用肝脏病杂志，2011，14（3）：169-172.

[14]汪美凤，平键，成扬.肝星状细胞主要信号转导通路与肝纤维化的关系.实用肝脏病杂志，2010，13（6）：466-469.

[15]Naoki U，Yasuyuki S，Hiroaki O，et al.Carbenoxolone inhibits DNA synthesis and collagen gene expression in rat hepatic stellate cells in culture.J Hepatol，2003，39:749-755.

[16]Di Sario A，Bendia E，Svegliati-Baroni G，et al.Rearrangement of the cytoskeletal network induced by platelet-derived growth factor in rat hepatic stellate cells:role of different intracellular signalling pathways.J Hepatol，2002，36（2）:179-190.

[17]Taylor CC.Platelet-derived growth factor activates porcine thecal cell phosphatidylinositol-3-kinase-AKT/PKB and ras-extracellular signal-regulated kinase-1/2 kinase signaling pathways via the platelet-derived growth factor-beta receptor.Endocrinology，2000，141（4）:1545-1553.

[18]李骢，周情，姜妙娜，等.肝复康对大鼠肝组织血小板衍生生长因子表达及对胶原合成的影响.实用肝脏病杂志，2012，15（2）:111-113.

[19]Lou JL，Jiang MN，Li C，et al.Herb medicine Gan-fu-kang attenuates liver injury in a rat brotic model.J Ethnopharmacol，2010，128:131-138.