自身免疫性肝炎患者外周血CD8+T淋巴细胞PD-1表达及意义*

艾 国 肖 芳 汪 鹏 严伟明 黄加权 宁 琴

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）的病因和发病机制迄今为止尚未得到完全阐明，遗传易感、病毒感染、自身免疫异常等多种因素均可能参与其发病[1]。程序性死亡因子（programmed death-l，PD-1）是CD28家族中新发现的传导抑制信号的共刺激分子，主要功能是调节T细胞的活化及分化[2]。PD-1及其配体（programmed death–ligand 1，PD-L1）相互作用可对初次免疫应答和记忆性或效应性T淋巴细胞功能进行负性调控，从而抑制免疫反应[3]。现有的研究表明，PD-1信号通路参与病毒性及微生物感染性疾病的进程[4，5]，在移植免疫[6]和肿瘤的免疫逃逸[7]中发挥着重要的作用。此外，PD-1的表达也与多种自身免疫性疾病如自身免疫性脑脊髓炎、糖尿病和系统性红斑狼疮等的发生发展相关[8～10]。然而，PD-1在AIH发病中的作用却鲜有报道。本研究拟通过检测AIH患者外周血CD8+T淋巴细胞PD-1表达情况，从疾病分期和性别的角度加以对比分析，以探讨其在AIH发生发展中的意义，为AIH的免疫损伤及发病机制研究提供新的理论依据。

资料与方法

一、研究对象 选取2012年9月至 2013年3月在我院就诊的AIH患者22例，男6例，女16例，平均年龄41.4±1.5岁。其中7例在服用泼尼松龙治疗后达到缓解，其余15例处于发病期未行免疫抑制剂治疗。同时选取健康献血者20例作为对照组，男8例，女12例，平均年龄29.0±0.5岁。病例诊断标准参考2008年国际免疫性肝炎小组（IAIHG）提出的AIH简化诊断积分系统及2010年美国肝病学会（AASLD）更新的有关 AIH的诊断和治疗指南[11，12]。排除肝炎病毒感染及药物性、酒精性和遗传代谢性肝病等。

二、主要试剂 FITC标记的小鼠抗人CD3单克隆抗体、APC标记的小鼠抗人CD8单克隆抗体、PE标记的小鼠抗人PD-1单克隆抗体、小鼠IgG同型抗体和红细胞裂解液均购自美国BD公司。

三、外周血淋巴细胞PD-1表达的检测 采集外周静脉血2ml，肝素抗凝，取100μL全血，分别加入小 鼠 抗 人 PD-l-PE、CD3-FITC和 CD8-APC各10μL，4℃避光孵育30min；加入2ml红细胞裂解液避光静置10min，加缓冲液洗涤3次后，取2%多聚甲醛300μL重悬细胞，立刻上机（BD FACS CantoTMⅡ型流式细胞仪）检测，用Cell Quest软件获取标本中的细胞，以FSC和SSC设门读取细胞，以CD3及CD8双阳性圈定为CD8+T淋巴细胞，再测定外周血CD8+T淋巴细胞PD-1阳性比例。

四、统计学处理 采用SPSS 15.0软件进行统计分析，以GraphPad Prism 5.0作统计绘图，数据用±s表示，两组计量资料比较用两独立样本非参数检验，P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示差异有显著统计学意义。

结果

一、AIH患者及健康对照外周血CD8+T淋巴细胞PD-1总体表达情况 22例AIH患者的CD8+T淋巴细胞PD-1表达率为2.56±0.45%，明显高于20例健康对照的0.46±0.06%，具有显著性差异（P<0.001，图1）。

图1 两组人群外周血CD8+T淋巴细胞PD-1表达的比较

二、不同疾病活动分期的AIH患者外周血CD8+T细胞PD-1表达的变化 在AIH发病期（15例），外周血CD8+T淋巴细胞PD-1表达频率为2.6±0.7%，略低于缓解期（7例）的3.4±0.8%，但无显著性统计学差异（P=0.5737）。

三、不同性别的AIH患者及健康对照外周血CD8+T淋巴细胞PD-1表达频率的比较 12例女性健康对照人群外周血CD8+T淋巴细胞PD-1表达率为0.32±0.1%，略高于8例男性人群的0.23±0.1%，但无显著统计学差异（P=0.6610）；16例女性AIH患者外周血CD8+T淋巴细胞PD-1表达率为3.5±0.7%，亦略高于6例男性患者的1.3±0.3%，但亦无显著统计学差异（P=0.1021）。

讨论

PD-1是近年来发现的负性协同刺激分子，为免疫球蛋白超家族I型跨膜糖蛋白，属于CD28超家族成员。PD-1与细胞毒性T淋巴细胞抗原4（cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA-4）具有 23%的氨基酸同源性[2]，但其表达却与CTLA-4不同，主要表达在活化的T细胞、B细胞和髓系细胞上[13]，说明PD-1比CTLA-4具有更广泛的免疫调节作用。PD-1与其配体 PD-L1（B7-HI）或 PD-L2（B7-DC）结合后，通过其胞浆尾部的免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM基序）传入抑制信号，在免疫应答中发挥负性调控作用[3]。诸多实验观察了PD-1与其配体结合后对T细胞发生的作用，认为PD-1整体上发挥免疫抑制作用，可抑制免疫反应的产生，对T细胞的增殖、细胞因子的分泌及杀伤能力都有抑制作用，阻断该通路后可以恢复T细胞的大部分功能[14，15]。在慢性HBV、HCV和HIV感染患者外周血T细胞尤其是病毒特异性CD8+T细胞PD-1表达均上调，使其免疫功能受到抑制，病毒不能被有效清除而造成持续感染状态 。

PD-1/PD-L通路抑制了免疫应答的初始与效应阶段，维持机体的免疫自稳，否则过强的免疫应答将导致自身免疫性疾病的发生[8]。而PD-1缺陷小鼠则可以发生自身免疫性疾病[9，10]。另外，在许多自身免疫病动物模型如实验性自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性糖尿病等动物，阻断PD-1/PD-L通路则加速疾病的严重程度及进展。对自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、Ⅰ型糖尿病、类风湿性关节炎患者PD-1基因座的单核苷酸多态性的检测也证实了这一点[18]。

本研究观察了PD-l在AIH患者CD8+T细胞上的表达，结果显示在AIH患者CD8+T细胞PD-1表达明显高于正常对照组，差异有显著统计学意义。我们推测PD-l的高表达可能是应对自身免疫反应的代偿，但增高的PD-1对于免疫反应的下调作用尚不足以控制疾病的发生和进展。而疾病缓解期PD-1表达略高于发病期，虽然差异无显著性，说明服用免疫抑制剂如糖皮质激素等可能通过增加PD-1的表达而发挥免疫抑制作用。PD-1/PD-L通路具有预防机体发生自身免疫或免疫亢进的作用，但PD-1/PD-L通路活化后结果与前端刺激信号的强弱、持续时间有关，抗原浓度与PD-1表达程度的相对关系可能与AIH等自身免疫性疾病的发生、发展关系密切。AIH患者淋巴细胞PD-1表达增高也可能是PD-1/PD-L通路在共刺激通路中的功能障碍或正性刺激过强超过了负性抑制作用，导致机体免疫耐受失衡，以致其对免疫反应的抑制性调控作用不能显现，继而发生病变。对不同性别的健康对照和AIH患者CD8+T淋巴细胞PD-1表达分析可以发现，PD-1在女性表达略高于男性，差异无显著意义，但为何女性更容易发生自身免疫肝炎则有待进一步研究。我们认为，PD-1在AIH患者体内表达增强的研究具有重要意义，外周血PD-1的检测可以作为明确患者存在自身免疫功能紊乱的参考指标。

本研究仅仅观察了PD-1在AIH患者CD8+T细胞的表达，而PD-1在其它细胞亚群以及B淋巴细胞上如何表达和PD-L在抗原递呈细胞的表达及其免疫调控作用仍需要进一步研究。包括PD-1在内的负性与正性协同刺激信号构成的复杂网络对AIH的免疫调节机理及信号转导机制仍需要更深层次的研究，能否通过上调负性协同刺激信号、阻断正性刺激信号而逆转AIH的进展，仍需进一步探索。随着分子靶向治疗时代的到来，认识并把握AIH的免疫发病机制有助于推动治疗AIH的抑炎与免疫调节新策略。

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