格尔德霉素体外抑制人肝癌细胞株HepG2增殖并促进凋亡

刘明强 庄少鹉 刘丽莎

原发性肝癌是指由肝细胞或肝内胆管细胞发生的肿瘤。作为人类最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在我国均较高，严重威胁着人民的健康和生命。我国是肝癌的高发区，全世界每年新发肝癌约为25万例，其中45%发生在中国，其死亡率在消化系统恶性肿瘤中列第三位，仅次于胃癌和食道癌。据统计，我国每年约有10万人死于肝癌。目前，对于原发性肝癌，传统的手术、介入和全身化疗等疗效欠佳，后者且具有很大的毒副作用。近年来，随着对肿瘤分子水平认识的不断深入，阻断肿瘤发生发展的信号通路逐渐成为抗肿瘤药物研究的热点领域。本课题试图通过抑制HepG2细胞热休克蛋白90（Heat Shock Protein 90，HSP90）的分子伴侣功能，从而实现对肝癌细胞内信号传导通路的多点阻断，以阻断肿瘤赖以生存的信号通路网络的功能发挥。

材料与方法

一、细胞与试剂 肝癌细胞株HepG2细胞（中国科学院上海细胞库）；格尔德霉素（Geldanamycin，GA，美国Alexis公司）；胎牛血清（中国杭州四季青公司）；DMEM培养基和0.25%胰蛋白酶（美国Gibco公司）；二甲基亚砜（DMSO）和 MTT（美国Sigma公司）；PBS（中国福州迈新试剂公司）；PI（美国Beckman公司）；Annexin V-FITC凋亡试剂盒（晶美生物工程有限公司）。

二、细胞培养 取HepG2细胞接种于细胞培养瓶内，用含15%胎牛血清的DMEM培养液置于37℃和5%CO2的培养箱中培养。2天传代1次，选择处于对数生长期的细胞进行试验。

三、细胞增殖抑制实验 采用MTT法，选择处于对数生长期的细胞，以每孔5.0×103个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200μl。培养24h，待细胞贴壁后弃培养液，更换含不同浓度（0.2、0.4和0.8μmol/L）GA的培养液200μl，分别继续培养12h、24h、48h和72h。更换无血清培养液，同时每孔加入MTT溶液（5mg/m1）20μl，37℃、5%CO2条件下孵育 4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150μl DMSO，振荡10～15min，使结晶物充分溶解。选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光度OD值。另设对照组（加培养液及细胞，不含药物）及空白组（只加培养液，不含细胞和药物），每个浓度设6个复孔。细胞增殖抑制率（%）=（对照组OD值－实验组OD值）／（对照组OD值－空白组OD值）×100%

四、细胞凋亡率检测 采用Annexin V法。取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，接种细胞于6孔培养板，24h后细胞贴壁，用无血清的培养液培养24h，使之同步化后弃培养液，更换含不同浓度（0、0.2、0.4和 0.8μmol/L）GA的培养液 200μl继续培养48h。与对照组细胞（只加培养液）同时收集，按晶美公司的Annexin V-FITC凋亡试剂盒说明进行检测，计算细胞凋亡率。

五、统计学处理 采用SPSS13.0统计软件，计量资料以±s表示，符合正态分布的计量资料采用方差分析进行统计处理，多组间指标的比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）、LSD-t或 SNK-q检验。对多个样本间非正态分布的资料（凋亡率）比较采用Kruskal-Wllis H检验，组间两两比较采用Nemenyi检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、GA对HepG2细胞生长的抑制作用 经不同浓度的GA干预后，HepG2细胞出现明显的增殖抑制现象，且随药物干预浓度和干预时间的增加，GA对HepG2细胞增殖抑制率逐渐增高，呈剂量－时间双效应关系（图1）。

图1 不同浓度GA对HepG2细胞增殖的影响

二、细胞凋亡的变化 在不同浓度的GA干预48h后，HepG2细胞凋亡率随着药物浓度的增加而渐增，且各组间细胞凋亡率有显著性差异（P＜0.05，表1和图2、图3）。

表1 不同浓度GA作用48h后HepG2细胞凋亡率（%，±s）的变化

表1 不同浓度GA作用48h后HepG2细胞凋亡率（%，±s）的变化

与对照组比，①P＜0.05

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图2 对照组HepG2细胞凋亡

图30.8μM GA诱导HepG2细胞凋亡

讨论

HSP90是一类广泛存在于原核与真核细胞胞质中的高度保守的同型二聚体分子伴侣，可参与多种蛋白质的折叠和构象形成，在蛋白质的稳定和成熟过程中起重要作用。HSP90是一种ATP依赖的伴侣蛋白，并且具有ATP酶的活性。当ATP与HSP90的N-末端ATP结构域结合后，HSP90构象发生改变，两个N末端发生短暂结合形成一个“关闭”（close）状环形结构，同时与HSP90结合的辅分子伴侣发生相应的转换，此时，HSP90的受体蛋白处于稳定的状态，并能够与配体结合或是能对刺激作出应答。当ATP水解成ADP后，HSP90的构象再次发生改变，与其结合的辅分子伴侣再次发生相应的转换，复合物中的受体蛋白被释放出来，随后经过泛素化-蛋白酶体途径降解[1～4]。

目前被发现的HSP90的受体蛋白已经超过100种，其中大部分蛋白质与细胞信号通路的转导有关[5]。这些HSP90的受体蛋白主要包括：跨膜酪氨酸激酶（HER-2／neu、EGFR、MET、IGF1R）、亚稳信号蛋白（Akt、Raf-1和 IKK）、成熟信号蛋白（p53、kit、Flt3、v-Src）、嵌合信号蛋白（NPM-ALK、Bcr-Abl）、甾体激素受体和细胞周期调节因子（cdk4和cdk6）等[6～9]。其中有一部分受体蛋白（如 Akt、Raf-1、HER-2/neu、CDK 4、CDK 6、Apaf-1、Nrf2等）与细胞周期的调节、细胞的转化、细胞存活和与凋亡的信号转导通路等有关[10，11]。因此，HSP90作为广泛存在于细胞内的一类高度保守的分子伴侣，可通过维持其受体蛋白的稳定与活性而间接参与细胞内多条重要的信号通路的转导，从而多途径多环节影响肿瘤的发生和发展进程，其独特的性质使其成为抗肿瘤治疗的良好分子靶点。

GA属于苯醌安莎霉素类抗生素，起初GA的抗肿瘤效果被认为是特异性抑制酪氨酸激酶，但研究揭示其抗肿瘤能力是依赖于致瘤性蛋白激酶在蛋白酶体中的降解。目前，通过免疫沉淀技术和X线结晶研究揭示证实，GA在体内可与ATP竞争结合HSP90 N端的结合位点，从而改变HSP90构象，使其不能与受体蛋白及辅分子伴侣形成复合体，抑制其行使正常的分子伴侣功能，最终导致受体蛋白降解。本研究利用GA抑制HepG2细胞内HSP90分子伴侣功能可能阻断肿瘤细胞赖以生存的信号通路网络，破坏肿瘤细胞的生长优势，发挥抗肿瘤作用。

本研究显示，HSP90功能抑制剂GA可抑制肝癌HepG2细胞的生长增殖，抑制作用呈时效量效依赖关系。GA作用后HepG2细胞出现明显的凋亡，而且随着药物浓度的增高，GA对HepG2细胞的凋亡诱导作用增强，证实了HSP90在肝癌HepG2细胞增殖及存活中起重要作用。

我们发现GA能剂量依赖性地抑制肝癌HepG2细胞的增殖和诱导其凋亡，其机制可能主要为GA通过抑制HSP90的分子伴侣功能，导致其受体蛋白的降解，实现了肿瘤细胞内相关信号通路的阻断，从而最后影响到肿瘤细胞生长。当然，细胞增殖及凋亡的调控是细胞因子间相互作用和相互影响而形成的复杂网络，GA抑制人肝癌细胞增殖及促进其凋亡的作用，还可能通过多种细胞因子多种途径来实现。相信在不久的将来，随着研究的不断深入和实验技术的不断推陈出新，GA多种抑瘤作用的分子机制将逐渐被阐明，这将为GA临床应用治疗肝癌及多种恶性肿瘤提供新的理论依据。

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