黑曲霉固体发酵法提取燕麦麸中β－葡聚糖

张 玉 良，田 晶，徐 龙 权，于 淼

(1.大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034；2.大连美罗大药厂，辽宁 大连 116036)

0 引 言

常用的β－葡聚糖提取方法包括化学法和物理法，这些方法往往会溶解掉部分可溶性纤维，而可溶性纤维却是膳食纤维中起重要生理功能的部分[1]。应用生物技术方法可以有效提取水溶性β－葡聚糖，通过啤酒酵母、酒精酵母、黄酒酵母和酿酒酵母发酵来提取燕麦麸中的β－葡聚糖均能使提取率提高[2]。黑曲霉发酵产生多种活性很高的酶系，如淀粉酶、果胶酶、蛋白酶等[3]，可利用黑曲霉的这些性质，在发酵燕麦麸的过程中有效去除果胶、淀粉等杂质，从而提高β－葡聚糖纯度。目前尚未见黑曲霉发酵法提取燕麦麸中β－葡聚糖的报道。本研究尝试采用具有淀粉酶、果胶酶等丰富酶系的黑曲霉发酵的方法来提取燕麦麸中的β－葡聚糖。

1 材料与方法

1.1 主要材料、菌种、培养基

燕麦麸，大连医诺生物有限公司提供；黑曲霉(Aspergillusniger)sp.48s，由大连工业大学菌种保藏所提供；察氏培养基，0.1MPa灭菌15min。

1.2 方 法

1.2.1 黑曲霉种子液的制备

将斜面上的黑曲霉菌体用接菌环接于液体培养基中，充分摇匀后放入水浴恒温摇床中30℃、160r／min振荡培养。

1.2.2 燕麦麸固体发酵方法

取燕麦麸20g于250mL锥形瓶中，灭菌后倒入种子液，搅拌均匀，置于30℃恒温培养箱中发酵，每隔2h摇瓶一次。在发酵过程中，首先对黑曲霉的菌龄、接种量、发酵温度、培养时间等条件进行单因素试验，在此基础上，通过正交试验确定燕麦麸中β－葡聚糖的最佳提取工艺。

1.2.3 燕麦麸中β－葡聚糖的提取

将发酵后的燕麦麸在200mL pH 10的碱液80℃下浸提2h，离心后用95%乙醇醇析，干燥，得到β－葡聚糖产品。对在最佳条件下得到的β－葡聚糖进行二次醇析。

1.2.4 刚果红法检测β－葡聚糖含量

称取0.2g产品倒入40mL去离子水中，加热充分溶解，4 000r／min离心20min；取上清液5mL稀释600倍，从稀释液中取6mL于比色管中，加入4mL刚果红显色，反应30min，于紫外分光光度计550nm下检测吸光度。通过标准曲线计算出产品纯度。

提取率＝β－葡聚糖产品质量／原料总质量

纯度＝产品中β－葡聚糖的质量／产品总质量

1.2.5 琼脂糖凝胶柱层析法测定β－葡聚糖的相对分子质量

通过对 Dextran系列标准品 T－70、T－500、T－2000及β－葡聚糖产品进行凝胶色谱分析，绘制出标准曲线，计算得出β－葡聚糖相对分子质量。

1.2.6 β－葡聚糖黏度的测定

根据GB 10247—1988采用乌氏黏度计测定β－葡聚糖水溶液的黏度。将β－葡聚糖溶解后稀释到质量分数为0.02%，以去离子水作为参照样，分别测量30、40、50、60、70、80℃试验所得产品及市售产品水溶液的黏度。

2 结果与讨论

2.1 种子液菌龄对产品纯度的影响

在菌体转接到液体培养基时起，分别从种子液中取生长时间为7、10、13、17、20h的种子液20mL，接入20g燕麦麸进行发酵，培养温度30℃，发酵时间17h，考察种子液菌龄对产品纯度的影响，结果如表1所示。种子液菌龄在10h时产品纯度最高，因此将种子液菌龄定为10h。

表1 种子液菌龄对产品纯度的影响Tab.1 Effect of Aspergillus niger age on purity of product

2.2 接菌量对产品纯度的影响

分别选取5、10、15、20、25mL种子液对燕麦麸进行发酵，考察接菌量对产品纯度的影响，结果如表2所示。可以看出，当接菌量较少时β－葡聚糖的纯度极低，说明当接菌量过少，菌体产酶不足，无法充分发酵燕麦麸，导致产品纯度低；当接菌量增加到15mL时，β－葡聚糖的纯度有显著提高；加大接菌量后，β－葡聚糖的纯度没有进一步提高，反而略有下降。因此，15mL为最适接菌量。

表2 接菌量对产品纯度的影响Tab.2 Effect of volume of seed－liquid on purity of product

2.3 发酵温度对产品纯度的影响

分别在20、25、30、35、40℃发酵燕麦麸17h，考察发酵温度对产品纯度的影响，结果如图1所示。由图1可见，黑曲霉在30℃时发酵燕麦麸得到的β－葡聚糖产品纯度最高，为43.99%。

图1 发酵温度对产品纯度的影响Fig.1 Effect of fermentation temperature on purity of product

2.4 发酵时间对产品纯度的影响

在种子液菌龄10h、用菌量为15mL、发酵温度30℃条件下考察发酵时间对产品纯度的影响，结果如图2所示。随着发酵时间的延长，产品的纯度提高，发酵时长10h为最高，继续加长发酵时间，产品纯度降低。这说明当发酵时长超过10h，黑曲霉中果胶酶、淀粉酶等酶活力降低，除杂效果不佳。

图2 发酵时间对产品纯度的影响Fig.2 Effect of fermentation period on purity of product

2.5 正交试验确定发酵条件

通过以上试验可以看出，种子液的菌龄、接菌量、发酵温度、发酵时间等条件都对发酵结果有较大影响，因此做多因素水平的正交试验来确定最佳试验条件，结果如表3、表4所示。发酵因素的主次关系依次为种子液菌龄、用菌量、发酵时间、发酵温度，其中发酵温度的影响因素最小。最适发酵条件为：种子液菌龄10h，发酵时间10h，发酵温度30℃，用菌量15mL。

表3 正交试验水平因素表Tab.3 Factor and level table of orthogonal experiment

表4 正交试验条件与结果表Tab.4 Conditions and results of orthogonal experiment

2.6 提取条件的验证

将20g燕麦麸接入15mL种子液(种子液的菌龄为10h)，30℃发酵10h，提取到的产品采用刚果红法检测，经二次醇析后，β－葡聚糖提取率为6.28%，纯度为52.53%。

2.7 β－葡聚糖相对分子质量以及黏度的测定

2.7.1 相对分子质量

相对分子质量是β－葡聚糖的一个重要特性，直接影响β－葡聚糖的溶解性、黏度及其生理活性。根据“1.2.5”中所述方法，由线性回归方程y＝－0.019 2x＋7.710 4计算出本产品的相对分子质量为2.8×106。该结果与Wood等[4]报道的β－葡聚糖相对分子质量3.0×106较接近，而Bhatty等[5]报道的结果为2.0×106。综合近年来的报道，由于提取方法、提取条件以及相对分子质量测定方法的不同，得到β－葡聚糖的相对分子质量分布范围也不尽相同。

2.7.2 黏 度

考察温度对β－葡聚糖溶液黏度的影响，结果如图3所示。由图3看出，随着温度的升高，β－葡聚糖的黏度降低。产品黏度水平与市售燕麦麸中提取的β－葡聚糖相当。说明采用黑曲霉固体发酵法提取到的β－葡聚糖具有较好的热稳定性。

图3 温度对β－葡聚糖溶液黏度的影响Fig.3 Effect of temperature on viscosity ofβ－glucan

3 结 论

采用黑曲霉发酵燕麦麸提取β－葡聚糖，可得到较高纯度水溶性膳食纤维，最佳提取条件为：种子液菌龄10h，用菌量15mL，发酵温度30℃，发酵时间10h。所得燕麦麸中β－葡聚糖的相对分子质量为2.8×106，提取率为6.28%，纯度为52.53%，产品稳定性较好。

[1]章海燕，张晖，王立，等.燕麦β－葡聚糖的研究进展[J].粮食与食品工业，2009，16(6)：8－12.

[2]潘妍，何聪芬，韩扬，等.发酵法提取燕麦β－葡聚糖的初步探索[J].食品与发酵工业，2009，35(4)：116－118.

[3]王宜雷.微生物学[M].北京：化学工业出版社，2010：39－44.

[4]WOOD P J，WEISZ J，BLACKWELL B A.Molecular characterization of cereal beta－D－glucans.Structural analysis of oat beta－D－glucan and rapid structural evaluation of beta－D－glucans from different sources by high－performance liquid chromatography of oligosaccharides released by lichenase[J].Cereal Chemistry，1991，68：31－39.

[5]BHATTY R S.Laboratory and pilot plant extraction and purification ofβ－glucan from hulless barley and oat brans[J].Journal of Cereal Science，1995，22：163－170.