响应面法优化黑曲霉固态发酵产木聚糖酶工艺

周 薇 薇，尹 亚 辉，赵 长 新

(大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034)

0 引 言

木聚糖(xylan)是自然界中含量仅次于纤维素的可再生生物资源。木聚糖酶(xylanase)是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一类酶的总称，它可以将木聚糖降为寡聚木糖、木糖和少量单糖[1－2]。国内在木聚糖酶方面的研究起步较晚，迄今为止，国内学者报道对木聚糖酶的研究基本上还仅限于对产木聚糖酶天然优良菌株的筛选、酶的纯化和一些酶学性质研究方面，只克隆了少数木聚糖酶基因。我国每年都会生产大量农业脚料，如玉米芯、稻壳、秸秆等，绝大部分因难以利用仅作为农家燃料。这些物质中都含有大量的木聚糖，若利用木聚糖酶将其转化为低聚木糖，既可处理农业废料，变废为宝，保护环境，又可促进我国低聚糖工业的发展，因此对木聚糖酶制剂的研究将具有十分可观的社会效益和经济效益[3－5]。本试验利用农业废弃物作为发酵基质，对黑曲霉产木聚糖酶的发酵条件进行了探讨，其结果可为木聚糖酶的开发和研制提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

黑曲霉(AspergillusnigerFIP－09－24)，大连工业大学菌种保藏所；菌种保藏培养基：PDA培养基；种子培养基：麸皮与水按质量比1∶1拌匀，pH自然；基础产酶培养基：麸皮12.5g、大麦渣12.5g、硫酸铵质量分数2%、吐温80体积分数0.15%、葡萄糖质量分数0.1%、水体积分数50%，pH自然。

种子培养：挑取3环菌苔，接入种子麸曲培养基中，混匀后在28℃培养72h后备用。

发酵产酶：将种子按接种量3%接入产酶基础培养基中，28℃培养。

1.2 方 法

1.2.1 酶活力的测定

称取2g粉碎后的固态发酵物，转移到50mL的磷酸缓冲液(0.02mol／L、pH 6.5)中，4℃抽提12h后用漏斗过滤，滤液即为所需酶液，测定木聚糖酶活力[6]。

1.2.2 单因素试验

研究碳源(麸皮与大麦渣的比例)、含水量、氮源与培养时间对产酶的影响。

1.2.3 响应面试验

根据单因素试验结果，选择影响显著因素碳源、含水量、氮源，运用响应面法优化试验条件。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 碳源对产酶的影响

在基础产酶培养基中，去掉原有碳源，分别加入按如下质量比为1∶1、1∶4、2∶3、3∶2、4∶1的麸皮与大麦渣，并保证总质量为25g，28℃培养72h后测定酶活，结果见图1。

图1 碳源对产酶的影响Fig.1 Effect of proportion of bran and barleycorn on xylanase production

由图1可知，当麸皮与大麦渣按质量比4∶1配制培养基时，木聚糖酶酶活达到最高为48 842U／g，因此最佳产酶麸皮与大麦渣之比为4∶1。这是因为麸皮中富含多糖、蛋白质、维生素和矿物质等常用的培养基成分，它既是碳源又是氮源，还含有某些对微生物生长和产酶起促进作用的因子。但麸皮过多，培养基黏性增大，不利于透气，影响生产规模和产量；而大麦渣含有丰富的木聚糖，又能增加培养基孔隙，但大麦渣过多，菌丝生长慢，酶活低。

2.1.2 含水量对产酶的影响

在麸皮与大麦渣比例为4∶1的基础产酶培养基中，去掉原有水分，分别加入50%、55%、60%、65%、70%的蒸馏水。28℃培养72h后测定酶活，结果见图2。

图2 含水量对产酶的影响Fig.2 Effect of water on xylanase production

由图2可知，含水量为55%时，木聚糖酶酶活达到最高为52 352U／g。这是因为水分的高低会影响到基质的透气性和菌丝生长状况，也会影响到代谢活动和目的产物的合成。高于最佳水分含量，将使麸皮的透气性降低，氧气输送量减少；而低于最佳水分含量将导致固态底物中营养物质的可溶性下降，而微生物也得不到足够的水分进行生长产酶。

2.1.3 氮源对产酶的影响

由图3可知，在麸皮与大麦渣比例为4∶1、含水量为55%的基础产酶培养基中，去掉原有氮源，分别加入1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的硫酸铵。28℃培养72h后测定酶活，结果见图3。

图3 氮源对产酶的影响Fig.3 Effect of nitrogen sources on xylanase production

由图3可知，含氮量为2.0%时，木聚糖酶酶活达到最高为52 460U／g。这是由于培养基中营养物质浓度合适时微生物才能良好生长，营养物质浓度过低时不能满足微生物正常生长所需，浓度过高则对微生物生长起抑制作用。本试验中采用的硫酸铵属于无机盐，而适量的无机盐能维持和促进微生物的生长，过量反而会起到抑制或杀菌作用。

2.1.4 培养时间对产酶的影响

将麸曲种子按照3.0%的接种量接种到经优化后的产酶培养基中，28℃分别培养12、24、36、48、60、72、84h后测定酶活，结果见图4。

图4 培养时间对产酶的影响Fig.4 Effect of culture time on xylanase production

由图4可知，培养时间为60h时，木聚糖酶酶活达到最高为65 888U／g，因此最佳产酶时间为60h。这可能是因为发酵时间长会产生其他代谢产物，抑制了酶活性，所以培养时间以60h为宜。

2.2 响应面试验

根据单因素试验结果所确定的最佳反应条件，采用二次回归通用旋转正交设计(三因素三水平)试验，其中三因素包括含水量(X1)、麸皮与大麦渣质量比(X2)和氮源含量(X3)，考察木聚糖酶酶活力，因素和水平取值见表1。

表1 因素水平表Tab.1 Factors and levels

黑曲霉固体发酵产木聚糖酶影响因素响应面分析试验设计与结果见表2。

利用Minitab 15软件对以上各试验点的响应值进行回归分析，得出回归模型方程为

该方程表明木聚糖酶酶活与所选的3个因素之间的线性关系显著，即试验方法可靠。回归方程的平方项系数都较大，说明响应值与试验因子之间的关系并不是简单的线性关系；而一次项和交互项系数较小，说明响应面分析所选3个因素之间的交互效应较小。对回归方程进行方差分析，验证回归模型，进行显著性检验，结果见表3、4。

表2 响应面分析试验结果Tab.2 Results of RSM analysis

表3 回归方程中回归系数的估计值Tab.3 The value of regression coefficient in regression equation

从表3和4中可以看出，X1X1、X3X3对木聚糖酶的酶活有显著影响，X2X2对木聚糖酶酶活的影响是极显著的，说明响应值与试验因子之间的关系并不是简单的线性关系。失拟项P＞0.05表明该方程可以接受。可以利用该回归方程确定最优的产木聚糖酶的培养基成分。

运用Minitab 15软件对数据进行处理，得出曲面图，结果如图5～7所示。

表4 Box－Behnken试验设计结果分析Tab.4 Result analysis of Box－Behnken experiments

2.3 验证性试验

响应值(Y)最大值时的各因子水平为：X1＝0.136，X2＝－0.089，X3＝0.025，转换后得到最佳培养基配方为：含水质量分数为55.7%、麸皮与大麦渣之比为3.8∶1、含氮质量分数为2.0%。在此条件下进行发酵产酶试验，预测所得酶活为65 943U／g。为了检验模型预测的准确性，依据响应面试验优化得到的培养基组成，进行验证试验，得到木聚糖酶活性为66 002U／g，与模型预测值相差0.1%，与理论值基本相符。

3 结 论

讨论了不同条件对黑曲霉固体发酵产木聚糖酶的影响，确定了最优发酵条件组合为：麸皮与大麦渣质量比为3.8∶1、含水质量分数55.7%、含氮质量分数2.0%。并在此条件下进行了验证试验，得到的木聚糖酶活性为66 002U／g，与模型预测值相差0.1%，可见该模型可以较好地预测实际发酵情况。在响应面法确定的最佳发酵条件下，菌体所产酶活较之单因素条件下所产酶的活性提高了114U／g。

[1]孙迅，王宜磊，邓振旭，等.半纤维素生物转化研究进展[J].微生物学杂志，1997，17(1)：50－55.

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[3]苏玉春，陈光，白晶.木聚糖酶的产生条件优化[J].吉林农业大学学报，2008，30(6)：793－796.

[4]吴小刚，黄东平，曾莹.黑曲霉产木聚糖酶发酵条件的研究[J].氨基酸和生物资源，2007，29(2)：26－29.

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[6]TABKA M G，HERPOEL－GIMBRT I，MONOD F.Enzymatic saccharification of wheat straw for bioethanol production by a combined cellulose xylanase and feruloyl esterase treatment[J].Enzyme and Microbial Technology，2006，39(4)：897－902.