槐耳多糖提取及抗氧化性质的研究*

刘苗苗，黄巧娘，郭立忠

(青岛农业大学生命科学学院，山东 青岛 266109)

槐耳，学名槐栓菌 (Trametes robiniophila Murr)，属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、非禇菌目、多孔菌科、栓菌属，是一种珍稀的药用真菌。多糖是真菌中极为重要的活性成分，报道证实多糖具有抗癌［1］、抗肿瘤、增强机体免疫功能等作用［2］。多糖的提取工艺已经达到比较成熟的水平，传统提取方法有微波提取法［3］、酸提法、酶提法等［4］，但都存在多糖纯度低、成本高、易变质等缺点［5］。

细胞在代谢过程中会不断产生带有1个以上不配对电子的原子、原子团或分子的自由基，自由基具有高度氧化活性;当机体内自由基过量时，会引起脂质过氧化、蛋白质变性、DNA链断裂、细胞解体等，严重损伤机体［6］。研究多糖的抗氧化性，有利于寻找到有效且无毒的自由基清除剂［7］。目前，关于槐耳多糖抗氧化能力的研究鲜有报道。

本实验在传统提取多糖的方法上适当改进，通过冷碱法、热碱法、普通法、高温高压法等不同方法提取槐耳子实体中的粗多糖组分，测定其多糖含量，再以DPPH法检测不同组分相同质量浓度下槐耳多糖抗氧化性质的强弱。通过比较得到1种多糖含量较高且性状稳定的提取方法，并实现对槐耳多糖抗氧化能力的初步探究。

1 材料

1.1 原料

槐耳子实体由青岛农业大学应用真菌省级重点实验室提供。

1.2 试剂

DPPH(11－二苯基－2－三硝基苯肼)购于Sigma公司;重蒸馏苯酚购于上海生工生物科技有限公司;葡萄糖、尿素购于天津市广成化学试剂有限公司;甲醇、正丁醇购于天津市博迪化工有限公司;三氯甲烷、氢氧化钠、浓硫酸、无水乙醇均购于莱阳市康德化工有限公司。

Sevag试剂:氯仿与正丁醇按5∶1的体积比配制。

DPPH标准液:准确称取DPPH粉末0.099 g，用分析纯甲醇溶解并定容到250 mL棕色容量瓶中，此标准液的浓度即为 1.0 ×10－4mol·L－1。

1.3 仪器设备

6202型小型台式高速粉碎机，欣镇企业有限公司;GTR22－1型高速冷冻离心机，北京时代北利离心机有限公司;YHG－50×55－S型远红外快速恒温干燥箱，上海跃进医疗器械厂;LRH－250A型生化培养箱，东省医疗器械厂;752型紫外可见分光光度计，上海舜宇恒平科学仪器有限公司等。

2 方法

2.1 槐耳多糖的提取

预处理:将一定量的槐耳子实体置于烘箱中烘至恒重，再用粉碎机将其粉碎成粉末状。称取10份子实体粉末，每份25 g，置于烧杯中，以10∶10∶3的比例分别加入三氯甲烷200 mL、甲醇200 mL、蒸馏水60 mL，搅拌均匀后于25℃下放置48 h进行脱脂处理，抽滤烘干。按不同方法提取多糖。

2.1.1 冷碱法

取1份脱脂后的槐耳子实体干粉，加入50 g NaOH、25 g尿素、500 mL蒸馏水，用玻璃棒搅匀后置4℃提取48 h，后用HCl调pH至中性。4 500 r·min－1离心10 min，使上清液中彻底除去子实体碎末。将上清液浓缩至粘稠状，缓慢加入4倍体积的无水乙醇，在4℃放置24 h后，离心弃上清，沉淀进行冷冻干燥，即得粗多糖。

2.1.2 热碱法

除提取条件设为65℃提取1 h外，其它步骤同冷碱法，最后所得组分即为热碱法粗多糖。

2.1.3 普通法

取1份脱脂后的槐耳子实体干粉，加入蒸馏水500 mL，于90℃煮提2 h，抽滤后向子实体残渣中再次加入500 mL蒸馏水，90℃煮提2 h，抽滤。合并2次上清液，4 500 r·min－1离心10 min，使上清液中彻底除去子实体碎末。将上清液浓缩至粘稠状，缓慢加入4倍体积的无水乙醇，在4℃放置24 h后，离心弃上清，沉淀进行冷冻干燥，即得普通法粗多糖。

2.1.4 高温高压法

取7份脱脂后的槐耳子实体干粉，其中1份除提取温度设为121℃外，其它步骤同普通法，所得组分即为高温高压法粗多糖。

另外6份分别按下述方法处理。

(1)高温高压分级醇沉法

取2份脱脂后的槐耳子实体干粉，分别加入蒸馏水500 mL，在121℃条件下煮提2 h，抽滤后向残渣中再次加入500 mL蒸馏水，121℃煮提 2 h，抽滤，合并 2次上清液，4 500 r·min－1离心10 min，将上清液分别浓缩至粘稠状。取1份用Sevage法做除蛋白处理，即向槐耳多糖浓缩液中加入1/4体积的Sevag试剂，混合振荡30 min进行分离，静置，取水相，重复该处理2次～3次。另1份不做。向上清中缓慢加入1倍体积的乙醇 (乙醇终浓度1/2)，在4℃放置24 h后，离心得一级醇沉多糖;上清再加1倍体积的乙醇 (乙醇终浓度2/3)，在4℃放置24 h后，离心得二级醇沉多糖;上清再加1倍体积的乙醇 (乙醇终浓度3/4)，在4℃放置24 h后，离心得三级醇沉多糖;上清再加入1倍体积的乙醇 (乙醇终浓度4/5)，在4℃放置24 h后，离心得四级醇沉多糖。沉淀分别进行冷冻干燥，即得4种不脱蛋白的分级醇沉粗多糖和4种脱蛋白的分级醇沉粗多糖。

(2)脱蛋白高温高压分倍醇沉法

取4份脱脂后的槐耳子实体干粉，分别加入蒸馏水500 mL，在121℃条件下煮提2 h，抽滤后向残渣中再次加入500 mL的蒸馏水，121℃煮提2 h，抽滤，合并2次上清液，4 500 r·min－1离心10 min，将上清液分别浓缩至粘稠状。按上述方法做除蛋白处理。充分混匀后将其导入分液漏斗，静止3 h，分液清晰后除去有机层和蛋白乳化层，重复2次。除蛋白后的上清液分别加入1倍、2倍、3倍、4倍体积的乙醇，在4℃放置24 h后，离心弃上清，沉淀分别进行冷冻干燥，即得4种脱蛋白的分倍醇沉粗多糖。

2.2 粗多糖含量测定

测定方法参考《中华人民共和国农业行业标准 NY/T 1676－2008食用菌中粗多糖含量的测定》［8］。

2.3 抗氧化能力的测定

将各种方法提取出的槐耳多糖配制成浓度为0.25 g·L－1的待测样品溶液。取2.0 mL待测样品溶液，加入2.0 mL DPPH标准液，立即混匀，在室温条件下静置30 min后，以蒸馏水调零，于517 nm处测吸光度值Ai。多糖对DPPH清除率R(%)的计算公式为:

R=［1－(Ai－Aj)/A0］×100%式中:Ai为待测样品溶液与DPPH标准液反应后的吸光度;Aj为未加入DPPH标准液时的吸光度，即待测样品溶液2.0 mL，甲醇溶液2.0 mL;A0为未加入待测样品溶液时的吸光度，即DPPH标准液2.0 mL，甲醇溶液2.0 mL。

每一样品平行测3次，取平均值，计算清除率。

3 结果和分析

3.1 多糖含量测定

以冷碱法、热碱法、普通法和高温高压法为主要方法提取槐耳多糖，分别测其多糖含量，见表1。

表1 不同方法提取槐耳多糖的多糖含量

从表1得知，利用高温高压法提取的多糖，其多糖含量最高，为34.59%，故又对槐耳子实体进行了高温高压分级醇沉和脱蛋白高温高压分倍醇沉处理，其中高温高压分级醇沉法又设置了未脱蛋白组和脱蛋白组进行比较，数据见表2。

表2 高温高压分级醇沉法提取槐耳多糖的多糖含量

表2数据显示，在高温高压分级醇沉实验中，脱蛋白组所得多糖的多糖含量明显优于未脱蛋白组，但2组均是经过二级醇沉后多糖含量最高，分别为29.24%和41.32%。脱蛋白高温高压分倍醇沉法提取槐耳多糖的多糖含量见表3。

表3 脱蛋白高温高压分倍醇沉法提取槐耳多糖的多糖含量

由表3可知，在脱蛋白高温高压分倍醇沉实验中，经过3倍醇沉处理后的槐耳多糖，其多糖含量最高，为33.52%。

综合以上数据，经过脱蛋白处理的高温高压二级醇沉法所得多糖的多糖含量最高，为41.32%。

3.2 DPPH法测定抗氧化能力

不同方法提取槐耳多糖的抗氧化性情况见图1。

由图1可知，冷碱法、普通法和高温高压法所提多糖对DPPH的清除能力相差不大，而热碱法所提多糖对DPPH的清除率达到45.71%，明显优于其它3种方法。高温高压分级醇沉法提取槐耳多糖的抗氧化性情况见图2。

图2显示，随着醇沉级数的增加，未脱蛋白组和脱蛋白组多糖对DPPH的清除能力均呈逐渐下降趋势。通过比较可知，脱蛋白组中经过一级醇沉处理所得多糖的抗氧化性最强。脱蛋白高温高压分倍醇沉法提取槐耳多糖的抗氧化性情况见图3。

由图3可知，随着醇沉倍数的增加，多糖的清除能力呈逐渐下降趋势，一级多糖清除率最高，为53.37%。

综合以上数据，经过脱蛋白处理的高温高压一级醇沉法所得多糖，其抗氧化能力最强，为54.73%。

4 讨论

本实验通过7种不同方法提取槐耳中的粗多糖成分，分别对其多糖含量和抗氧化能力进行测定。数据表明，多糖含量的高低与抗氧化能力的强弱并不呈正相关。本研究中，多糖含量最高、抗氧化性最强的槐耳多糖分别是经过脱蛋白处理的高温高压二级和一级醇沉多糖，含量分别为41.32%和54.73%。

槐耳野生资源稀缺，人工培育困难。本实验的进行，无论是在多糖含量上还是抗氧化性方面，都证明脱蛋白高温高压分级醇沉法优于其它方法，这为实现槐耳多糖的高效利用提供了一种可借鉴的提取技术，且初步证明槐耳多糖具有较好的自由基清除能力，是一种有效的天然抗氧化物质，为全面开发槐耳在医药、保健品中的应用提供了理论依据。

在高温高压法延伸实验中，经过脱蛋白处理的一级和1倍醇沉多糖，它们的多糖含量理论上应该是一致的，但实际检测结果为31.18%和23.02%，这表明本实验脱蛋白处理的效果还不够理想，尤其在分倍醇沉多糖时，其中的蛋白质清除不够彻底。脱蛋白组一级多糖对DPPH的清除率高于未脱蛋白组的一级多糖，四级多糖则明显小于未脱蛋白组。分析原因，在槐耳中抗氧化作用最为有效的成分可能是多糖蛋白复合体，一级多糖中可能带有更多的蛋白，使其对DPPH的清除能力增强，而四级多糖蛋白去除率高，导致其抗氧化性减弱。同时Sevag试剂脱蛋白也有其不足之处，如处理次数不够、工艺流程长、水相和有机相较难分离等因素均会影响实验结果，且本实验只采用DPPH法检测槐耳多糖的抗氧化能力，邻苯三酚自氧化法、Feton法、应用色谱法等其它测定方法对槐耳多糖不同分子量段抗氧化性强弱的检测有待进一步研究。

［1］吕赤．槐耳清膏对结肠癌SW40细胞生长抑制作用及其机制研究［D］．中国医科大学，2010．

［2］陶金国，卢伟东，徐丽丽，等．槐耳子实体多糖对于STZ诱导的小鼠I型糖尿病治疗效果的初步研究［C］．中国菌物学会第三届药用真菌学术研讨会论文集，2011:87－97．

［3］张自萍．微波辅助提取技术在多糖研究中的应用 ［J］．中草药，2006，37(4):630－632．

［4］朱小霞，罗学刚．多糖提取与纯化技术应用进展［J］．食品研究与开发，2007，28(3):186－188．

［5］ Bum ChumLee，Jun TaeBae，Hyeong BaePyo，et al．Biological activities of the polysaccharides produced from submerged culture of the edible Basidiomycete Grifola frondosa［J］．Enzyme and Microbial Technology，2003，(32):574－581．

［6］赵保路．自由基、营养、天然抗氧化剂与衰老［J］．生物物理学报，2010，26(1):26－36．

［7］林桂兰．食用菇多糖提取物体外抗氧化性能研究［J］．华东理工大学学报:自然科学版，2006，32(3):278－281，317．

［8］NY/T 1676－2008，食用菌中粗多糖含量的测定 ［S］．中华人民共和国农业行业标准，2008．