复方猴头菇对小鼠免疫功能的影响*

2013-09-19余梦瑶许晓燕

中国食用菌 2013年3期

魏巍，余梦瑶，江南，许晓燕，罗霞

(四川省中医药科学院，四川成都 610041)

猴头菇Hericium erinaceus(Bull.er Fr.)Pers.，隶属于担子菌门 (Basidiomycota)、猴头菌科 (Hericiaceae)真菌，是我国传统的药食两用真菌，因其形似猴头，故称“猴头菇”，其味鲜美无比，营养丰富，是四大名菜之一，有“山珍猴头、海味燕窝”之称。除其营养丰富外，猴头菇还有丰富的真菌多糖、猴头菌素等生物活性成分［1］，中医认为，猴头菇性平味甘，具利五脏、助消化、滋补身体等功效，临床上主要用于治疗消化性溃疡［2］、萎缩性胃炎［3］、肝炎以及胃癌的辅助治疗［4］。据现代药理研究发现猴头菇还具有提高机体免疫、抗肿瘤等作用［5］。

通过研究发现，当猴头菇子实体与其多糖提取物在一定比例上进行配比后的复方猴头菇 (Compound Hericium erinaceus，CHE)，其免疫作用大大增强。对此，将通过药理实验对复方猴头菇配方比例进行筛选，并对其免疫调节作用进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

1.1.1 猴头菇与猴头菇多糖提取物

猴头菇产自四川省德阳市，洗净烘干后，粉碎过100目筛。猴头菇多糖提取物，按刘重芳等［6］使用方法制备，其中多糖以葡萄糖计，采用硫酸—蒽酮法测定含量为32%。

1.1.2 试剂

氢化可的松注射液，山西晋新双鹤药业有限责任公司，国药准字H14020980;注射用环磷酰胺 (CY)，山西泰盛制药有限公司，国药准字H14020373;RPMI－1640培养基购自Gibco公司;胎牛血清、小牛血清购自Hyclone公司;MTT、ConA、LPS购自Sigma公司;印度墨汁购自 Chroma公司;LDH测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所;其它试剂为国产分析纯。

1.1.3 动物与细胞株

动物:昆明种标准小鼠，体重18 g～22 g，雌雄各半，SPF级，合格证号为SCXK(川)2008－19。

细胞株:YAC－1细胞株 (小鼠淋巴瘤细胞株，ATCC编号:TIB－160)，购自中科院细胞所。

1.1.4 仪器

紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司，TU－1800;酶标仪，Thermo Multiskan Ascent;电子天平，Mettler Toledo AL104;细胞培养箱，Heraeus BB16UV等。

1.2 试验方法

1.2.1 不同配方的CHE对小鼠血清溶血素抗体生成的研究

小鼠50只，随机分为5组，每组10只，配方1、配方2、配方3中猴头菇粉与多糖提取物的比例为10∶1、8∶1、6∶1(2 g·kg－1)，空白组和模型组给予同等体积的蒸馏水，连续给药30 d。在首次给药后第23天，每只小鼠腹腔注射5%鸡红细胞溶液0.2 mL。在第23天、第25天、第27天，除正常组腹腔注射生理盐水外，其余小鼠均腹腔注CY 20 mg·kg－1。末次给药30 min后，从小鼠眼后静脉丛取血20 μL，加入盛有1 mL生理盐水的试管中，并加入4%鸡红细胞溶液0.5 mL，15%豚鼠血清0.5 mL，在37℃水浴中静置1 h后，放入冰水中终止反应10 min，2 000 r·min－1离心10 min，取上清液1 mL，加入3 mL临时配制的血红蛋白应用液中，于540 nm处比色［7］。

1.2.2 不同配方的CHE对小鼠迟发型超敏反应 (DTH)的研究

动物分组与给药同1.2.1。首次给药后第24天小鼠腹部去毛部位用25 μL·只－1的1%DNFB－丙酮溶液致敏，第26天同法同一部位强化1次，除正常组腹腔注射生理盐水外，其余小鼠在第24天、第26天、第28天腹腔注射CY 50 mg·kg－1，第29天在小鼠右耳涂以1%DNFB－丙酮食用油 (v∶v=3∶7)溶液10 μL，24 h后将小鼠处死，剪耳朵于电子天平称取左右耳。以左耳与右耳的差值 (mg)和肿胀度作为小鼠DTH 反应强度［8］。

1.2.3 CHE对小鼠血清溶血素抗体生成的研究

小鼠50只，随机分为5组，每组10只，其中高剂量组、中剂量组和低剂量组每组分别经口给予复方猴头菇粉0.5 g·kg－1、1 g·kg－1、2 g·kg－1，实验方法同 1.2.1。

1.2.4 CHE对小鼠迟发型超敏反应的研究

动物分组与给药同1.2.3，实验方法同1.2.2。

1.2.5 CHE对小鼠碳粒廓清能力的研究

动物分组与给药同1.2.3。给药后第23天～第29天，除正常组皮下注射生理盐水外，其余小鼠均皮下注射氢化可的松25 mg·kg－1。给药后第30天，小鼠灌胃30 min后，小鼠按0.1 mL/10 g体重尾静脉注射以1%明胶配制的25%印度墨汁。于注射后30 s和6 min分别在小鼠眼后静脉丛用尖嘴吸管取血20 μL，加入盛有0.1%Na2CO32 mL溶液的试管中，摇匀后于675 nm处分别测定2次吸光值。迅速脱颈处死动物，称量肝、脾重量。按公式计算吞噬指数K和校正吞噬指数α，公式为［9］:

K=(lgOD1－lgOD2)/(T1－T2)，α =K1/3·W/WLS

式中:OD为吸光度;T为时间;W为体重;WLS为肝脾合重。

1.2.6 CHE对小鼠脾淋巴细胞增殖的研究

小鼠40只，随机分为4组，每组10只，高剂量组、中剂量组和低剂量组每组分别经口给予复方猴头菇粉0.5 g·kg－1、1 g·kg－1、2 g·kg－1，空白组和模型组给予同等体积的蒸馏水，连续给药30 d后脱颈处死，无菌取脾。以注射器芯在200目钢丝网上轻轻将脾磨碎，并滴加适量RPMI－1640培养液洗下细胞。收集细胞液，并加入等量0.83%Tris－NH4Cl溶液，静置5 min破坏红细胞。1 500 r·min 离心10 min收集细胞，以10%胎牛血清RPMI－1640培养液制成单细胞悬液，台盼蓝染色计数 (活细胞数应＞95%)。96孔板每孔加入1×106个细胞，每孔总体积为200 μL。每个样品各设9个复孔，其中3孔加入1 mg·mL－1ConA约2 μL，另3孔加入1 mg·mL－1LPS 2 μL，其余3孔不做处理。细胞培养板置37℃、5%CO2饱和湿度空气条件下培养3 d，于培养结束前4 h取出，从每孔中吸出 100 μL上清液，再加入 10 μL、5 mg·mL－1MTT，继续培养。培养结束后，每孔加10%SDS(用 0.01 mol·L－1的 HCl配制)100 μL，37℃ 下放置 4 h。振荡混匀，使结晶物充分溶解。在570 nm波长处用酶标仪测定每孔 OD 值［10］。

1.2.7 CHE对小鼠NK细胞活性的研究

动物分组、给药、配置单细胞悬液同1.2.6。配置好的单细胞悬液为效应细胞。取对数生长期的YAC－1细胞，离心收集细胞，并以10%胎牛血清RPMI－1640培养液制成单细胞悬液，台盼蓝染色计数 (活细胞数应＞95%)，此即为备用的靶细胞。在96孔板中，每孔加入效应细胞2×106个，靶细胞4×104个 (效靶比=50∶1)，每孔总体积为200 μL，每个样品设3个复孔。另设仅含靶细胞的靶细胞自然释放孔和仅含效应细胞的效应细胞自然释放孔，以及仅含靶细胞但培养液中含终浓度为1.25%Triton X－100的最大释放孔。细胞板1 000 r·min－1离心5 min，以使靶细胞和效应细胞充分接触。细胞培养板置37℃、5%CO2饱和湿度空气条件下培养4 h。培养结束后，吸取培养上清液100 μL，采用LDH测定试剂盒测定其中LDH含量。NK细胞杀伤率 (P)公式［11］为:

P=(OD1－ OD2－OD3)×100%/(OD4－ OD3)。式中:OD1为药物组OD值;OD2为效应细胞自然释放OD值;OD3为靶细胞自然释放OD值;OD4为最大释放OD值。

1.2.8 数据处理

数据均以x±s表示，采用SPSS 18.0软件进行数据分析，采用方差分析进行组间差异比较。

2 结果与分析

2.1 不同配方的CHE对小鼠血清溶血素抗体生成的影响

不同配方的CHE对小鼠血清溶血素抗体生成的影响见表1。

表1 CHE对小鼠血清溶血素抗体生成的影响

由表1可见，CY(20 mg·kg－1)使小鼠血清溶血素水平明显降低 (p＜0.01)。而灌胃不同配方的CHE后，血清溶血素抗体生成水平明显提高，其中比例2和比例3提高最为显著 (与模型组比较p＜0.01)，分别提高81%和85%。

2.2 不同配方的CHE对小鼠迟发型超敏反应的影响

不同配方的CHE对小鼠迟发型超敏反应的影响见表2。

表2 猴头菇复方对小鼠皮肤迟发型变态反应的影响

由表2可见，注射CY(50 mg·kg－1)，由DNFB引起的DTH明显减弱，模型组小鼠耳重差与肿胀度明显降低 (p＜0.01)。灌胃不同比例的复方猴头菇后，小鼠耳重差与肿胀度均明显提高，其中比例2和比例3提高最为显著 (与模型组比较p＜0.01)。

2.2.3 CHE对小鼠血清溶血素抗体生成的影响

CHE对小鼠血清溶血素抗体生成的影响见表3。

表3 CHE对小鼠血清溶血素抗体生成的影响

由表3可见，而灌胃CHE 30 d后，血清溶血素抗体生成水平明显提高，与模型组相比具有显著差异 (低剂量、中剂量p＜0.05，高剂量p＜0.01)并呈剂量关系。

2.2.4 CHE对小鼠迟发型超敏反应的影响

CHE对小鼠迟发型超敏反应的影响见表4。

表4 CHE对小鼠皮肤迟发型变态反应的影响

由表4可见，灌胃CHE 30 d后，小鼠耳重差与肿胀度明显提高，并呈剂量关系，给药组耳重差与肿胀度与模型组比较有显著差异 (低剂量p＜0.05，中剂量和高剂量p＜0.01)。

2.2.5 CHE对小鼠碳粒廓清能力的影响

CHE对小鼠碳粒廓清能力的影响见表5。

表5 CHE对小鼠碳粒廓清能力的影响

由表5可见，注射氢化可的松后 (25 mg·kg－1)，模型组碳粒廓清能力显降低，与空白组比较有显著性差异 (p＜0.01)。灌胃CHE 30 d后，小鼠碳粒廓清能力有明显提高，并呈剂量关系，中剂量组和高剂量组吞噬指数K和校正吞噬系数α与模型组比较有显著差异 (p＜0.05)。

2.2.6 CHE对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

CHE对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响见图1。

由图1可知，在未加入诱导剂条件下，CHE并不能增加小鼠脾淋巴细胞的增殖能力。但在T细胞丝裂原ConA或B细胞丝裂原LPS诱导下，CHE能够提高小鼠脾淋巴细胞的增殖能力，并呈剂量关系，中剂量组在ConA诱导下能显著增加小鼠脾淋巴细胞的增殖能力 (p＜0.05)，高剂量组在ConA或LPS诱导下能显著增加小鼠脾淋巴细胞的增殖能力 (p＜0.05)。

2.2.7 CHE对小鼠NK细胞活性的影响

CHE对小鼠NK细胞活性的影响见表6。

表6 CHE对小鼠NK细胞活性的影响

由表6可见，灌胃CHE 30 d后，小鼠NK细胞活性明显提高，并呈剂量关系，中剂量组和高剂量组NK细胞杀伤率与空白组比较有显著差异 (p＜0.05)。

3 讨论

通过小鼠血清溶血素抗体生成和小鼠迟发型超敏反应，对猴头菇粉与猴头菇多糖提取物的搭配比例进行了研究，结果发现当猴头菇粉与猴头菇多糖提取物达到8∶1时小鼠免疫功能提高最明显，但是再提高猴头菇多糖的含量，其免疫功能未有明显提高，因此选择比例2作为后续研究。本研究发现CHE在1 g·kg－1剂量下就能明显地增加小鼠溶血素的生成、提高小鼠迟发型超敏反应能力、加快单核巨噬细胞迅速度、刺激B细胞和T细胞的增殖能力和NK细胞的活性，能明显提高小鼠的免疫功能，并呈剂量关系。

以真菌自身与自身提取物或是以不同部位的提取作为搭配进行药理研究的报道较少，这种“配伍”方式主要在一些药用菌的药品和保健品中使用，例如据报道以灵芝孢子粉与灵芝提取物为主要成分的复方灵芝胶囊能提高小鼠免疫功能［12］，对S180肉瘤细胞、H22肝癌细胞与Lewis肺癌细胞生长均具有一定的抑制作用，并能增强环磷酰胺和5－氟尿嘧啶对S180肉瘤细胞的杀伤作用［13］。另外有研究表明猴头菇多糖、香菇多糖、茯苓多糖通过一定的搭配比例后组对荷瘤动物的肿瘤均有明显的抑制作用，作用效果明显优于香菇多糖［14，15］。这提示我们，在药用真菌中所表现生物活性的物质有多种，当这些活性物质在一个正确的比例时，就像中药复方，能明显的增强所表现的生物活性，这为药用真菌的开发提供了一个新的思路。

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