拮抗菌RY3抗菌粗蛋白理化性质及其对柑橘绿霉病菌的抑菌活性

陈召亮张 辉，2张娜娜，3乔勇进

CHEN Zhao－liang1ZHANG Hui1，2ZHANG Na－na1，3QIAO Yong－jin1

（1.上海市农业科学院农产品保鲜加工研究中心，上海 201403；2.上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093；3.上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234）

由柑桔绿霉病菌PenicilliumdigitatumSacc.引起的柑橘绿霉病是导致柑橘采后腐烂损失的重要病害，腐烂率一般为10%～30%，严重时可达60%以上，严重制约着柑桔采后的贮运及销售［1］。目前，化学杀菌剂处理是控制该病的主要方法［2，3］。但长期使用化学杀菌剂易使病原菌产生抗药性，且造成农药残留，环境污染、危害人类健康等［4，5］。采用微生物及其代谢产物控制果蔬采后病害及进行生物保鲜已成为今年研究的热点［6］。抗菌蛋白或抗菌多肽是许多生防微生物都能分泌的一类活性物质，具有抗菌广谱性和高效性、对人畜无毒、对环境无污染的优良特性，且病菌对其不易产生抗性［7］。随着人们食品安全意识和环保意识的增强，采用以抗菌蛋白为代表的生防制剂防治果蔬采后病害成为当今果蔬采后防腐保鲜的研究热点。

解淀粉芽孢杆菌RY3是从冬枣果园根际土壤分离筛选获得的一株高效拮抗细菌，前期预试验表明其发酵液对柑橘青绿霉病菌、桃褐腐病菌、冬枣浆胞病菌等多种水果采后致病真菌具有较高的抑菌活性。为明确该拮抗菌的抗菌物质的特性及对果蔬采后致病真菌的抗菌活性，本研究对其抗菌粗蛋白的理化性质及其对柑橘采后绿霉病菌的抗菌活性进行了研究，以期为该拮抗菌在果蔬采后防腐保鲜中的进一步开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

解淀粉芽孢杆菌RY3：由本实验室从冬枣果园根际土壤中分离获得；

柑橘绿霉病菌（Penicilliumdigitatum）：由本实验室从绿霉病发病柑橘果实上分离获得；

PDA培养基：200g马铃薯，20g葡萄糖，17g琼脂粉，1 000mL蒸馏水；

牛肉膏蛋白胨培养基（NA）［8］：牛肉膏5.0g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂18g、蒸馏水1 000mL、pH调至7.0；

发酵培养基：可溶性淀粉10g／L、黄豆饼粉5g／L、碳酸氢铵10g／L、碳酸钙5g／L，pH 调至7.0。

1.2 试验仪器

高速冷冻离心机：Allegra X－22R型，美国Beckman coulter公司；

摄像显微镜：Axioskop 2plus型，德国卡尔蔡司公司；

生化培养箱：SPX－250B－Z型，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；

旋转蒸发仪：BUCHI B－490型，瑞士Buchi公司；

空气浴摇床：HWY211型，上海智诚分析仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 抗菌粗蛋白的制备 将活化好的RY3菌种按2%接入装有125mL培养液的250mL的三角瓶中，在34℃、180r／min摇床上振荡培养30h后，取发酵液，10 000r／min离心20min，收集上清液。将上清液倒入无菌三角瓶中，加入 HCl（7mol／L）调节pH＝2，过夜沉淀。再分装于50mL的离心管，每管30mL，于4℃、10 000r／min离心25min，去上清液，向每管沉淀中加入1.5mL的甲醇（pH＝7），混合均匀，萃取8h。然后在4℃下10 000r／min离心20min，取上清液。同样方法萃取两次，合并上清液。将合并后的萃取液用旋转蒸发仪浓缩，每升细菌发酵液得到10mL抗菌粗蛋白。

1.3.2 抗菌粗蛋白理化性质研究

（1）热稳定性：将抗菌粗蛋白分别于50℃／60min，80℃／30min，80℃／60min，100℃／30min，100℃／60min的条件下进行水浴处理，采用悬滴法［9］测定其对柑橘绿霉病菌分生孢子萌发的抑制活性，每个处理重复3次，以未经热处理的抗菌粗蛋白为对照。

（2）对pH的稳定性：将抗菌粗蛋白用1mol／L的盐酸溶液和氢氧化钠溶液调节pH 至2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，14.0，并于4℃贮存过夜，再将各pH值用盐酸和氢氧化钠调回中性，测定其对柑橘绿霉病菌分生孢子萌发的抑制活性，每个处理重复3次，测定方法同上，以未经处理的抗菌粗蛋白做对照。

（3）对紫外线的稳定性：将抗菌粗蛋白在20W紫外灯下距离10cm 处，照射2，4，6，8，10，12，14，24h，测定其对柑橘绿霉病菌分生孢子萌发的抑制活性，每个处理重复3次，测定方法同上，以未经处理的抗菌粗蛋白做对照，设抑菌率为100%。

（4）对蛋白酶的稳定性：将抗菌粗蛋白分别用胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K在37℃处理60min，酶反应浓度为1mg／mL，测定其对柑橘绿霉病菌分生孢子萌发的抑制活性，每个处理重复3次，测定方法同上，不加蛋白酶处理为对照。

1.3.3 抗菌粗蛋白对柑橘绿霉病菌的抑菌活性

（1）抗菌粗蛋白对柑橘绿霉病菌分生孢子萌发活性的影响：首先制备不同稀释倍数的抗菌粗蛋白溶液和浓度为106个／mL的柑橘绿霉病菌分生孢子悬浮液（加入适量2%的蔗糖溶液），分别取抗菌粗蛋白、分生孢子悬浮液各1mL于编号试管中，充分混匀后，使抗菌粗蛋白稀释倍数分别为10，20，50，100，200，400倍，以无菌水作对照，然后将药液、孢子混合液滴在双凹片上，放在带有湿润滤纸的培养皿内悬滴，每处理重复3次，25℃静置培养24h，光学显微镜观察统计视野内孢子的总数和萌发的孢子数，按式（1）计算孢子萌发率，每重复调查100个孢子，以芽管长度大于分生孢子长直径即视为萌发。

（2）抗菌粗蛋白对柑橘绿霉病菌分生孢子萌发形态及菌丝形态的影响：采用琼胶表面孢子萌发法，抗菌粗蛋白和PDA培养基按1∶9的比例制备平板，制备稀释倍数为50倍的带毒平板，采用涂布法接种绿霉病菌悬浮液（1.0×106个／mL），用摄像显微镜对孢子萌发、菌丝形态进行拍照。

1.4 统计分析

试验数据采用SPSS 17.0软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 抗菌粗蛋白热稳定性

由表1可知，解淀粉芽孢杆菌RY3的抗菌粗蛋白经50℃处理60min、80℃处理30min和60min后其抑菌活性与对照相比几乎不变。经100℃处理30min和60min后抑菌活性略有下降。由此可见抗菌蛋白对热不敏感。

2.2 抗菌粗蛋白对pH的稳定性

由图1可知，酸性条件对抗菌粗蛋白的抑菌活性几乎无影响，当pH值为2至6时，RY3的抗菌粗蛋白的抑菌活性几乎无变化，均在原有活性的90%以上；碱性条件下抗菌蛋白活性下降明显，pH值为8时抑菌活性稍有下降；pH值为10和12时，抗菌粗蛋白的抑菌活性下降幅度较大，与pH值为6时差异极显著（P＜0.01）；当pH为14时，粗蛋白几乎失去活性。说明RY3的抗菌粗蛋白耐酸但不耐碱，pH为14时抗菌物质粗提物基本失去活性。

表1 不同温度处理对抗菌粗蛋白抑菌活性的影响Table1 Effect of different temperature on inhibitory rate of antifungal crude protein

图1 pH值对抗菌粗蛋白抑菌活性的影响Figure1 Effect of different pH on inhibitory activity of antifungal crude protein

2.3 抗菌粗蛋白对紫外线的稳定性

由表2可知，紫外线照射6h对抗菌粗蛋白的活性基本无影响，抑菌活性均在原有活性的90%以上，随着紫外光照射时间的继续延长，抗菌蛋白的抑菌活性开始缓慢降低，紫外光照射12h时抑菌活性为原有活性的71.94%。说明抗菌粗蛋白耐紫外线。

表2 紫外照射时间对抗菌粗蛋白抑菌活性的影响Table2 Effect of different time of ultraviolet radiation on inhibitory rate of antifungal crude protein

2.4 抗菌粗蛋白对蛋白酶的稳定性

由表3可知，该抗菌粗蛋白经胰蛋白酶、胃蛋白酶处理后，活性几乎不变；而蛋白酶K处理使其活性降低，但仍能保持原有活性的82.20%，说明抗菌粗蛋白对胃蛋白酶、胰蛋白酶不敏感，对蛋白酶K有一定的耐受性。

表3 不同蛋白酶对抗菌粗蛋白抑菌活性的影响Table3 Effect of different proteinases on inhibitory rate of antifungal crude protein

2.5 抗菌蛋白对柑橘绿霉病菌分生孢子萌发的影响

由图2可知，柑橘绿霉病菌分生孢子萌发活性随抗菌粗蛋白浓度的增加而降低，呈现明显的剂量效应，高浓度的抗菌粗蛋白对柑橘绿霉病菌分生孢子萌发具有显著的抑制活性，10，20倍抗菌蛋白稀释液处理，孢子萌发率仅为2.86%和10.98%，说明该抗菌粗蛋白对柑橘绿霉病菌分生孢子具有明显的抑制萌发活性。

图2 抗菌粗蛋白对柑橘绿霉病菌孢子萌发活性的影响Figure2 Effect of antifungal crude protein on germination activity of P.digitatum

2.6 抗菌粗蛋白对柑橘绿霉病菌分生孢子萌发形态和菌丝形态的影响

抗菌粗蛋白可明显影响孢子萌发形态和菌体形态，导致芽管和菌体的不正常生长。正常柑橘绿霉病菌孢子萌发的芽管及菌丝细长平滑（图3（a）和图3（c）），经抗菌粗蛋白处理后的孢子芽管膨大变短变粗（图3（b）和图3（d））。菌体变粗，发生菌体细胞质凝集现象（图3（e））和菌丝消融现象（图3（f））。

3 讨论

解淀粉芽孢杆菌是一类具有广谱抑菌活性的拮抗细菌，其主要通过产生抗菌物质包括抗菌蛋白和脂肽类抗生素来发挥抗菌活性［10，11］。在抗菌蛋白研究方面，目前中国报道的耐热抗菌蛋白较多［12，13］，但耐酸的抗菌蛋白报道相对较少［14］。本研究表明RY3产生的抗菌蛋白对热及酸稳定，耐紫外线，对胃蛋白酶、胰蛋白酶不敏感，对蛋白酶K具有一定的耐受性，这些性质说明该抗菌蛋白可适应特殊复杂的环境条件，具有良好的应用前景。

本研究中发现该抗菌粗蛋白对柑橘绿霉病菌分生孢子萌发具有明显的抑制活性，且可导致芽管肿大变短及菌体细胞质凝集、消融等畸形现象，这与孟利强等［15］和翟如环等［16］的研究结果一致。分生孢子是病原菌侵染的重要器官，柑橘绿霉病菌分生孢子活性萌发受到明显抑制，芽管及菌体畸形等可使其致病侵染力显著降低，从而可降低柑橘采后绿霉病的发生及有效减少采后损失。

图3 抗菌粗蛋白对柑橘绿霉病菌孢子萌发形态和菌丝形态的影响（10×40）Figure3 Effect of antifungal crude protein on spore germination and mycelial morphology of P.digitatum （10×40）

在抗菌蛋白提取方法的筛选过程中，曾采用了硫酸铵沉淀法，但是获得的抗菌粗蛋白抗菌活性较低，而采用酸沉淀法获得的抗菌粗蛋白具有较高的抗菌活性，说明该抗菌蛋白为小分子量蛋白。关于该抗菌蛋白的分离纯化、结构鉴定等工作有待于进一步研究。

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