CaCl2处理对苹果采后品质及炭疽病害的影响

赵 妍 杨 超 王若兰 宋永令

ZHAO YanYANG ChaoWANG Ruo－lanSONG Yong－ling

（河南工业大学粮油食品学院，河南 郑州 450001）

（College of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou，Henan 450001，China）

大多数果蔬产品的生产受到季节性和地域性的限制，往往集中在某一地区、某个时令大量上市，而目前中国果蔬类产品的采后保鲜系统还不完善，因此常常出现大量果蔬采摘后因处理不当而遭受病原微生物侵染以致腐烂变质的现象［1］。钙盐可以作为一种品质保护剂应用于果蔬采后保鲜，研究［2］表明其能够减缓果实贮藏过程中品质下降速率，这对于提高果实耐贮性有着积极的作用。

中国是苹果生产的第一大国，据联合国粮食及农业组织统计，2010年中国苹果产量为3 326万t，接近世界总产量的一半［3］。河南省地处黄河故道，是中国苹果的主要产区之一，因此，采后贮藏保鲜也是该地区苹果产业中的一项重要研究课 题［3］。苹果炭疽病是由炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）侵染所致，该病在中国北方苹果产区普遍发生。之前的大量研究表明：采后CaCl2浸泡处理可抑制苹果的呼吸作用，延缓苹果衰老［4］；而采前喷施CaCl2可以增加苹果果实钙含量、降低苦痘病等生理病害的发病率、并显著增加果实大小，改善着色品质［5］。但没有关于采后应用非化学杀菌剂CaCl2防治河南省苹果产区的炭疽病害、提高该地区果实抗病性的报道。吴芳芳等［6］研究认为CaCl2对C.gloeosporioides有一定的抑制作用，但并未对经CaCl2处理之后的苹果果实品质及抗病性做具体研究。本试验重点探讨CaCl2处理对河南产区苹果采后炭疽病害、贮藏品质及果实抗病性的影响，以期为该地区苹果采后非化学杀菌剂保藏提供一定的理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料和病原菌

试验用苹果品种为“首红”，七、八成熟时采摘于河南省荥阳苹果园。试验用苹果选取大小适中、颜色均匀、未被病虫害侵染、表皮无机械伤的果实。

病原菌苹果炭疽菌（C.gloeosporioides）分离于自然发病的苹果果实，由中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）鉴定。该菌种使用前于PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）培养基上活化培养7d，试验用孢子悬浮液用含有0.05%吐温－20的无菌水配置，其浓度为5×104个／mL。

1.2 CaCl2 抑菌试验

1.2.1C.gloeosporioides菌落直径测定 根据文献［7］测定不同浓度的CaCl2溶液（1%，2%，5%，10%）对病原菌C.gloeosporioides菌落直径的影响。不同CaCl2浓度均做3次平行试验。

1.2.2 孢子萌发率测定 根据文献［7］测定不同浓度的CaCl2溶液（1%，2%，5%，10%）对病原菌C.gloeosporioides孢子萌发率的影响。不同CaCl2浓度各做3次平行试验。

1.2.3 果实接种试验－病斑直径测定 首先配置1%次氯酸钠溶液，将供试果实浸泡其中消毒1min，之后果实分别浸入浓度为1%，2%，5%，10%的CaCl2溶液中（无菌水做对照，浸泡时间为10min）。

果实晾干后于赤道部位打一3mm×3mm的伤口并将配置好的C.gloeosporioides孢子悬浮液（15μL）接种于伤口中。果实贮藏于冷藏条件下（4℃，28d）并于贮藏期结束后测量果实病斑直径（采用十字交叉法）。每种浓度CaCl2溶液处理的果实数为30个，并做3次重复。

1.3 果实品质指标测定

苹果果实经预处理之后置于恒温恒湿箱中贮藏（4℃，28d），每7d取样测定果实的可滴定酸值、VC含量、可溶性固形物含量及果实硬度。试验所用果实数目为10个×3重复＝30个。

1.3.1 可滴定酸值 采用GB 12293－90中的电位滴定法。

1.3.2 VC含量 依据文献［8］，采用2，4－二硝基苯肼比色法。

1.3.3 可溶性固形物含量 采用手持折光仪测定。

1.3.4 苹果硬度测定方法 在苹果赤道部位两两相对取四点，使用FT327型果实硬度计配套的削皮器去果皮，插入硬度计测量，结果取4点平均值，单位转化为牛顿（N）。

1.4 果实病理指标测定

苹果果实预处理之后置于恒温恒湿箱中贮藏（4℃，28d），每7d取样测定果实木质素、总酚、MDA（丙二醛）含量及PAL（苯丙氨酸解氨酶）活性。每处理随机选取10个果实，整个试验重复3次。

1.4.1 木质素含量测定 木质素在植物抗病过程中发挥重要作用，其可限制病菌酶和病原菌分泌的毒素向寄主植物的扩散，同时限制了病原菌从寄主植物吸取水分和营养物质。木质素测定方法参照文献［9］并作部分修正。称取苹果果肉2g，加入95%乙醇研磨并离心抽滤。所余果肉残渣放入铝盒中干燥（105℃，1h）。干燥产物放入10mL具塞试管中，加入3mL乙酰溴－乙酸混合液（体积比1∶3），70℃下水浴30min。结束后置于冰水中、加入0.9mL浓度为2mol／L的NaOH终止反应，用冰乙酸定容至10mL。离心后取上清液0.5mL于10mL具塞试管中定容。280nm处测定吸光度，木质素含量用吸光度表示。

1.4.2 总酚含量测定 酚类化合物与植物的抗病性有密切关系，能够抑制真菌孢子萌发和菌丝生长，还能够钝化真菌分泌的一些酶。总酚标准曲线以没食子酸配制。测定方法：称取果肉样品1g，用70%丙酮研磨，定容至40mL后超声15min，用旋转蒸发仪除去丙酮，剩余匀浆离心后取上清液用乙醇定容至50mL，再吸取1mL用甲醇定容至50mL。取上清液1mL，置于25mL具塞试管内，其余操作同标准曲线制备部分，参照标准曲线计算试管中总酚含量，并按式（1）计算果实总酚含量。

式中：

R—— 总酚含量（以没食子酸计），mg／g；

m——25mL试管中总酚含量，mg／g；

M—— 所取果肉质量，g。

1.4.3 MDA含量测定 植物衰老会导致细胞内活性氧代谢平衡被破坏，产生大量自由基，自由基毒害会引发膜脂过氧化作用，破坏细胞膜结构和功能，而 MDA是膜脂过氧化的最终产物之一。其测定方法：称取2g苹果果肉，加入5mL TCA溶液（100g／L），研磨匀浆后冷冻离心20min（4℃，12 000r／min），取上清液2mL置于试管中，而空白组为2mL TCA溶液。分别向试验及空白组加入2mL浓度为0.67%的TBA，混匀煮沸20min后冷却。取上清液分别测定其在450，532，600nm的吸光值、计算果肉样品 MDA含量，结果以μmol／g·FW 表示。

1.4.4 PAL活性测定 PAL是植物苯丙烷类代谢途径的关键酶，其活性的高低与植物抗性反应中木质素、酚类物质、植物抗毒素等的生物合成有直接关系。参照文献［10］的方法加以改进：称取2g苹果果肉，加入4mL硼酸硼砂缓冲液（100mM，pH 8.7）冰浴研磨成均浆，4℃下12 000r／min冷冻离心20min，取上清液用于酶活测定。以每小时290nm吸光值增加0.01为一个酶活单位（U）。酶活性以U／g·FW（鲜重）表示。

1.5 统计分析

试验数据采用SAS 8.2统计软件进行邓肯氏多重差异比较。

2 结果与分析

2.1 CaCl2对C.gloeosporioides的抑制效果

由表1可知，CaCl2对C.gloeosporioides的菌丝生长、孢子萌发以及由其侵染所造成的苹果采后炭疽病均有明显抑制作用。体外试验结果显示：当CaCl2浓度为1%时就可以显著地抑制C.gloeosporioides的菌丝生长与孢子萌发（P＜0.05），且CaCl2浓度增大，对于C.gloeosporioides的抑制能力增强。果实接种试验结果显示：CaCl2浓度为2%时就可以显著地抑制苹果炭疽病病班直径的扩展，当CaCl2浓度上升到10%时，该效果更加显著（P＜0.05）。

2.2 苹果果实贮期主要品质指标变化规律

由图1（a）可知，随着储藏期的延长，各处理组苹果果实可滴定酸值均呈下降趋势。CaCl2处理可以减缓苹果果实可滴定酸值的下降速率，贮藏7d之后，10%和5%浓度CaCl2处理组果实可滴定酸值分别为0.66，0.50mmol／100g，是对照的1.63和1.25倍。

表1 CaCl2对C.gloeosporioides的抑制效果†Table1 The inhibitory effect of CaCl2 to C.gloeosporioides

由图1（b）可知，贮藏期间各组果实VC含量变化趋势相似，均随时间延长而逐渐下降。CaCl2处理不同程度地延缓了苹果果实VC的下降趋势，在贮藏期间，10%和5%浓度CaCl2处理组果实VC含量均显著地高于对照（P＜0.05）。

贮藏期间由于果实的呼吸作用和能量消耗，可溶性固形物含量均呈缓慢下降的趋势，CaCl2处理同样可以延缓苹果果实可溶性固形物的下降趋势，且该效果与CaCl2使用浓度呈正相关（图1（c））。

苹果果实采摘后内部乙烯含量上升，后熟作用渐强，呼吸作用增大，分解和消耗更多的有机物和糖类，果实渐渐衰老，硬度减小。由图1（d）可知，CaCl2处理对于维持苹果果实硬度效果显著，整个贮藏期间除了前7d，1%CaCl2处理组果实硬度与对照组无显著差异之外，其余各组果实硬度均显著地高于对照（P＜0.05），同样的，该效果与CaCl2使用浓度呈正相关。

图1 CaCl2对苹果贮期可滴定酸、VC、可溶性固形物含量和硬度的影响Figure1 Influence of CaCl2on the titratable acidity，vitamin C，soluble solids contents and firmness of apple fruit

2.3 苹果果实贮期抗病性相关指标变化规律

由图2（a）可知，各组木质素含量均呈上升趋势，在第14天时达到峰值，之后缓慢下降。整个贮藏期间，对照组木质素含量始终处于最低水平。在第14～28天时，各浓度CaCl2处理组果实其木质素含量均显著地高于对照，其中尤以10%浓度CaCl2处理的效果最为显著（P＜0.05）。

由图2（b）可知，各组果实总酚含量均在贮期的第14天达到峰值，之后迅速下降。在第14～28天时，经10%浓度CaCl2处理的果实其总酚含量始终维持在最高水平，显著地高于对照和其它3个CaCl2处理组（P＜0.05）。

CaCl2处理显著地提高了苹果果实贮期PAL活性，由图2（c）可知，在第14～28天时，各个CaCl2处理组果实其PAL活性均显著地高于对照（P＜0.05），且该效果与CaCl2的使用浓度呈正相关。

由图2（d）可知，各处理组果实MDA含量在第7天均达到峰值，推测是由于冷藏环境造成果实应激条件下积累大量活性氧，进而攻击自身细胞膜，产生膜脂过氧化产物所致。其中，对照组 MDA含量最高，为1.84μmol／g·FW，显著高于10%及5%浓度CaCl2处理组（P＜0.05）。随后的第7～21天，各组果实MDA含量迅速下降，而贮藏末期（第21～28天）均有不同程度的回升，尤以对照组变化明显，其MDA含量显著地高于其它各组（P＜0.05），这可能是由于贮藏末期果实衰老，品质下降所致。

图2 CaCl2对苹果贮期木质素、总酚、MDA含量及PAL活性的影响Figure2 Influence of CaCl2on the content of lignin，total phenolic，MDA and PAL activity of apple fruit

3 结论

（1）CaCl2对C.gloeosporioides有一定的抑制作用，体外试验中可以显著抑制其菌丝生长与孢子萌发，体内试验则可以显著降低其对苹果果实的侵染能力，且该效果与其使用浓度呈明显正相关关系。苹果果实在贮藏期内主要品质指标均随时间推移而下降，但CaCl2处理能够明显减缓果实品质下降趋势，该效果同样与CaCl2使用浓度正相关。10%浓度CaCl2处理可以诱导苹果果实PAL活性升高并显著减少MDA积累以保护细胞膜通透性，同时果实木质素与总酚含量均显著高于对照，与之相应的是苹果果实对于炭疽病的防御能力增强。

（2）随着贮藏期的延长，果实逐渐衰老，主要品质指标如可滴定酸、VC、可溶性固形物含量下降，但CaCl2处理能够延缓其下降速率，这和前人的研究结论［11］相一致，主要是由于外源钙能抑制呼吸基质的代谢，降低线粒体活力，从而降低果实的呼吸作用，延缓果实的衰老。此外，CaCl2处理能够增加苹果果实硬度，该试验结果与对于其它果蔬的研究结论［12，13］相一致。之前的研究结果证实：PAL是植物苯丙烷类代谢途径的关键酶，其活性升高会促进木质素、酚类物质等的生物合成［14］，而果实伤口处细胞壁沉积的木质素及酚类物质会在伤口处形成屏障，阻止水分散失、病原菌入侵或对病原菌有直接毒性［15］。本研究表明CaCl2处理可以诱导苹果果实PAL活性上升、木质素及总酚含量升高，并增强对C.gloeosporioides侵染的抵御能力，该结果符合前人的研究结论并进一步丰富了相关理论知识。

（3）本试验主要研究了CaCl2处理对河南地区苹果采后炭疽病的防治效果，而对其它可能发生的采后病害如轮纹病、黑星病等未做研究，今后将加大研究范围；此外，本研究采用的苹果果实储藏条件为4℃，并未对常温贮藏条件下的相应指标进行测定，今后将补充完善本部分内容；最后，本试验研究表明CaCl2处理可以诱导苹果果实采后抗病性，但并未对诱导机理从分子水平进行阐明，今后拟将采用基因组学的分析方法细致深入的探讨苹果采后抗病性的诱导机理。

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