长沙青皮竹多糖脱蛋白质方法研究

殷 凯 李湘洲 张 胜 王乙庚

YIN KaiLI Xiang－zhouZHANG ShengWANG Yi－geng

（中南林业科技大学材料科学与工程学院，湖南 长沙 410004）

长沙青皮竹 （Bambusatextilisvar.persistens.B.M.Yang）为湖南省优良观赏竹种［1］，原产地为湖南长沙。竹叶中含有多种对人体有益的活性物质，如黄酮、多糖、氨基酸和微量元素［2－4］。竹叶黄酮的生物活性和提取分离已经有众多学者进行了研究报道［5－7］，竹叶多糖由于有增强机体免疫及抗肿瘤、抗疲劳、抗氧化、降血糖和保护肝脏等作用，近年来也受到越来越多的关注。

研究多糖的生理活性，首先要获得纯度较高并具有天然活性的多糖［8］。然而，提取的多糖中通常会含有蛋白质，影响多糖的纯度，并使其药理研究出现较大偏差［9］。在多糖的结构鉴定、活性成分等研究环节往往需要较大量的粗多糖脱除蛋白质操作，粗多糖中脱除蛋白质的方法主要有Sevag试剂法［10］、三氯乙酸法［11］、生物酶法［12］、大孔树脂法［13］以及聚酰胺吸附法［14］等，其中最常用的是Sevag试剂法和三氯乙酸法。生物酶法多采用蛋白质酶降解多糖中的蛋白质，但酶自身亦是蛋白质，可能在脱除蛋白质的同时又混入新的杂质。方积年等［15］反对用大孔树脂，认为其适合分离小分子物质，如果分离纯化多糖易使多糖活性降低。

聚酰胺是由酰胺聚合而成的一类高分子物质，它对酚类、醌类及黄酮类等富含酚羟基的化合物具有较强的吸附性能［16－18］，聚酰胺理化性质稳定，吸附选择性独特，使用周期长，操作方便，不产生二次污染性质，是一种友好型的分离方法。但总体而言，该方法应用在多糖纯化方面的报道还较少。在脱除多糖中游离蛋白质方面，孟利等［14］曾用聚酰胺吸附法去除西藏灵菇胞外多糖发酵液中的蛋白质，脱除率为81.59%，总糖回收率达到87.75%；张民［19］采用聚酰胺吸附法去除枸杞多糖中的蛋白质，蛋白质的含量下降到4.7%，枸杞多糖的回收率为98.7%。但是聚酰胺吸附法应用于竹叶多糖的纯化，尚未见公开报道。

本试验以长沙青皮竹为研究对象，分别采用聚酰胺吸附法、三氯乙酸法、Sevag试剂法去除长沙青皮竹叶多糖中的蛋白质，以脱蛋白质过程中多糖损失率和蛋白质去除率作为衡量脱蛋白质效果的考察指标，为竹叶多糖的分离纯化寻求适宜的蛋白质脱除方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验材料

长沙青皮竹竹叶：2012年10月采集于中南林业科技大学竹园，经该校林学院陈建华教授鉴定为长沙青皮竹（Bambusatextilisvar.persistens.B.M.Yang）。竹叶自然风干后，用万能粉碎机粉碎，过20目筛，经乙醇回流脱脂、热水提取、醇沉离心、冷冻干燥即得青皮竹竹叶多糖。准确称取适量竹叶多糖，用去离子水溶解，过滤除去不溶物，配制成5.0mg／mL多糖溶液备用。

1.1.2 仪器

冷冻干燥机：LGJ－10型，北京松源华兴科技发展有限公司；

台式高速离心机：TG16－WS型，长沙平凡仪器仪表有限公司；

可见分光光度计：721N型，上海精密科学仪器有限公司。

1.1.3 主要试剂

聚酰胺：柱层析用80～100目，浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂；

考马斯亮蓝G－250：上海西塘生物科技有限公司；

其它试剂：均为市售分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 Sevag试剂法脱蛋白质 取3支试管，分别加入4mL粗多糖溶液，各滴加1mL Sevag试剂（氯仿∶正丁醇＝4∶1），恒 温 （35 ℃）振 荡 30min，4 000r／min 离 心15min，取上清液，再滴加1mL Sevag试剂，振荡离心，重复操作4次，直至有机相与水相界面处不再出现白色胶状物，测定上清液中蛋白质及多糖的含量。

1.2.2 三氯乙酸法脱蛋白质 取3支试管，分别加入4mL多糖溶液，各滴加4mL 3%三氯乙酸溶液，摇匀，于4℃冰箱中静置12h，4 000r／min离心20min，取上清液，测定其蛋白质及多糖的含量。

1.2.3 聚酰胺吸附法脱蛋白质 聚酰胺去除杂质后，准确称取10.0g，上柱压实平整。将25mL多糖溶液经过恒流泵注入柱床，静置12h后，用5倍体积的去离子水洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发浓缩至25mL，分别测定浓缩液中的蛋白质与多糖含量。同时考察5.0，7.5，12.5，15.0g聚酰胺对多糖中蛋白质的清除情况，平行试验3次。

1.3 测定方法

1.3.1 多糖含量的测定 采用苯酚－硫酸法［20］。在体积一致的前提下，多糖损失率计算公式见式（1）。

式中：

R1——多糖损失率，%；

c0—— 脱蛋白质前溶液中多糖含量，mg／mL；

c1—— 脱蛋白质后溶液中多糖含量，mg／mL。

1.3.2 蛋白质含量的测定 采用考马斯亮蓝法［21］。在体积一致的前提下，蛋白质脱除率计算公式见式（2）。

式中：

R2——蛋白质脱除率，%；

d0—— 脱蛋白质前溶液中蛋白质含量，mg／mL；

d1—— 脱蛋白质后溶液中蛋白质含量，mg／mL。

2 结果与分析

2.1 聚酰胺用量对脱蛋白质效果的影响

聚酰胺不同用量脱蛋白质效果的比较见表1。由表1可知：聚酰胺的用量对于脱除竹叶粗多糖中蛋白质的效果影响显著。随着聚酰胺用量的增加，洗脱液中所含的蛋白质不断降低，表明聚酰胺吸附蛋白质的量呈增大趋势；但在吸附蛋白质的过程中，多糖损失率也呈增大趋势。当聚酰胺用量超过10.0g以后，蛋白质脱除率的效果趋于平衡，而多糖损失率增加明显。因此聚酰胺用量控制在10.0g为宜。由此也可推导出0.5mg／mL的多糖液与聚酰胺用量的最佳比例是25mL∶10.0g，即液固比为2.5∶1（V∶m）。

表1 不同质量聚酰胺脱蛋白质效果的比较Table1 Comparision about different quality of polyamide（n＝3）

2.2 3种方法脱除蛋白质效果的比较

以2.1获得的最佳聚酰胺用量，对青皮竹粗多糖进行蛋白质脱除，3种脱蛋白质方法的效果比较见表2。由表2可知：从多糖损失率的角度而言，3种方法中三氯乙酸法处理后多糖损失率最大，Sevag试剂法多糖损失率最小。而从蛋白质脱除效果考察，则三者蛋白质脱除率依次为聚酰胺吸附法＞三氯乙酸法＞Sevag试剂法。

表2 3种脱蛋白质方法的效果比较Table2 Comparision of three deproteinization methods（n＝3）

3 讨论与结论

聚酰胺是一种吸附型色谱，它可以根据物质中所含的氨基、羟基、氢键与共轭双键的多少对物质进行吸附。一方面，由于蛋白质分子中富含氨基和氢键，因此蛋白质分子可以被聚酰胺吸附，并且去离子水不能将其从聚酰胺色谱柱上洗脱下来［14］；另一方面，虽然多糖是一种多羟基结构的物质，但多糖易于形成分子内氢键导致它与聚酰胺形成氢键的能力减弱［19］。因此，蛋白质吸附在聚酰胺色谱柱上，而多糖则被去离子水洗脱下来，从而达到将多糖与蛋白质分离的目的。

在以往多糖的分离纯化过程中多采用Sevag法脱蛋白，但Sevag法往往要重复多次才能达到脱除蛋白质的目的，且操作所使用的有机溶剂为氯仿、正丁醇等，对操作人员的安全有一定影响，而且萃取蛋白后的有机试剂无法完全回收使用，客观上对环境也会产生一定的污染。三氯乙酸酸性较强，在使蛋白质变性的同时也易使多糖结构发生变化［22］，如果在此工艺下继续纯化多糖，还需对多糖溶液进行中和，也会对多糖的鉴定造成局部影响。

而聚酰胺法在设定的条件下，一次脱除蛋白的效果就优于Sevag试剂法和三氯乙酸法，并且聚酰胺可循环使用。同时，使用去离子水作为溶剂，对比其他方法使用有机溶剂或者酸性较强的溶剂而言，对操作人员和环境均无负面影响。因此聚酰胺脱蛋白质是一种值得推广的方法。

本研究结果还发现，聚酰胺在脱除蛋白的同时，对长沙青皮竹多糖也有一定的影响，损失率为30.86%，且损失率随着聚酰胺用量的增加而增加，较文献［14］、［19］报道的西藏灵菇胞外多糖、枸杞多糖损失率都要高。推测长沙青皮竹多糖中应有部分多糖在结构上缀有蛋白，导致聚酰胺对这部份多糖也有吸附作用，这一现象为今后开展长沙青皮竹多糖的结构鉴定提供了一些研究思路，相关研究结果将另文报道。

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