纳米银颗粒通过血脑屏障中剂量-效应关系的初步研究

汤京龙 王 硕 刘 丽 王春仁 奚廷斐

(1中国食品药品检定研究院，北京，100050)

(2北京大学深圳研究院，深圳 518055)

因为具有比传统抗菌剂更优的抗菌效果，纳米银已在医药卫生领域得到广泛的应用[1-2]。现在临床使用的纳米银医用产品主要包括妇科用的纳米银凝胶、纳米银敷料、纳米银医用导管等几种[3-5]。据不完全统计，国内已有20多家企业生产的纳米银产品应用于临床，在中国使用范围已遍布20多个省、直辖市和自治区。

但是近年来国内外的研究显示，纳米银颗粒具有在体内迁移的特性，能够以颗粒状形态进入血液循环系统并在体内迁移、分布，最终以颗粒状形态蓄积在肝、肾、脾、脑、肺等器官中，在某些情况下还能引起这些器官发生毒性反应[6-8]。特别是发现纳米银颗粒可以使血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)发生异常，并通过血脑屏障进入脑部，使部分脑神经元细胞变性[9]。但是，现有研究还无法说明纳米银颗粒通过血脑屏障机理。本研究中由纳米银颗粒通过血脑屏障的剂量-效应关系的研究，来初步推测纳米银颗粒通过血脑屏障的机理。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究中采用的纳米银颗粒和微米银颗粒，和Tang等的文献报告相同[10]。纳米银颗粒(Sigma，产品号为576832)是粒径在10～100 nm范围内的球形颗粒，微米银颗粒(Sigma，产品号为327107)是粒径范围在2～20μm之间的含有不规则钝角的立方体。

1.2 体外血脑屏障模型的建立

本研究中根据Tang等在文献[11]中的报告，建立体外血脑屏障模型。首先在体外分别培养大鼠脑毛细血管内皮细胞 (brain microvessel vascular endothelial cells，BMVECs)和大鼠星形胶质细胞(astrocytes，ACs)；然后将培养好的两种细胞分别种植于多孔底碟(transwell)上聚碳酸酯微孔膜的两侧；最后将种植两种细胞的transwell放入细胞培养池中培养，直至测试跨脑毛细血管内皮细胞电阻值大于等于400Ω·cm-2时，建立的模型可供下一步试验使用。

这个体外BBB模型的特点是：在transwell上聚碳酸酯膜的上表面形成一层均匀的脑毛细血管内皮细胞单层；下表面星形胶质细胞的突起可穿过膜孔与脑毛细血管内皮细胞相接触，比较近似的模拟出体内BBB结构；这个transwell上的细胞模型能够将培养池分为供池和受池两部分；供池代表脑毛细血管腔；受池代表的是血脑屏障外的脑部(图1)。

1.3 纳米银颗粒通过血脑屏障的剂量-效应关系

1．3．1 试验分组

试验分为3组，分为对照组、纳米银组(剂量分别为 25，50，100，200，400 μg·mL-1)和微米银组(剂量 分别 为 100，400 μg·mL-1)， 其 中 对 照 组 采用DMEM 培 养 液 (Dulbecco′s modification of Eagle′s medium Dulbecco)作为试验样品，纳米银组采用纳米银颗粒/DMEM混悬液作为试样，微米银组采用微米银颗粒/DMEM混悬液作为试样。

1．3．2 试验方法

1．3．2．1 模型的建立及样品的加入

参照1．2的方法，建立试验用体外BBB模型。将各组样品加入到已通过验证的完整的BBB体外模型的供池中共同培养，每孔2 mL，静置4 h。以上试验平行进行5组。

1．3．2．2 银含量的测定

4 h后，停止反应，由平行进行5组试验中随机取4组，从各自的BBB模型中收集样品。包括(1)取出所有样品供池中的培养液，此部分样品不用被弃除；(2)取出多孔底碟(Transwell)，将碟上聚碳酸酯膜(包括吸附在膜上的BMVECs和ACs)切下，用双蒸水洗涤2～3次，将附在BMVECs和ACs表面的银颗粒洗掉 (这部分银颗粒是反应过程中因重力沉降在细胞表面的银颗粒)，收集备用；(3)再收集各样品受池中的全部培养液。

向收集的各样品中加入5 m L浓硝酸 (ρ＝1．42 g·mL-1，优级纯)，消解定容。 在 ICP-MS上测定各样品在定容液中的银浓度(ppt)，并计算得到各样品中银质量(μg)，再分别换算成其所占加入的银总量的百分比。

各组试验的结果以平均值±标准偏差表示，SPSS12．0进行处理，各试验组之间相同位置(BBB细胞内或受池内)银含量数据用单因素方差分析，LSD法做均数的多重两两比较，p＜0．05为显著性差异。

1．3．2．3 血脑屏障超微结构的观察

将1．3．2．2剩余的一组试验样品的聚碳酸酯多孔膜切下，用 2．5%多聚甲醛-2．5%戊二醛，4 ℃固定 1．5～2 h，按文献[7]制备超薄切片，在透射电镜(H-7650°日立透射电子显微镜，日立高新技术(上海)国际贸易有限公司)上观察脑毛细血管内皮细胞状态及细胞间紧密连接的状态，放大倍数为1万倍至12万倍。

2 结 果

2.1 血脑屏障中银通过率的测定

各试验组受池中银含量的测试结果列于表1。这一部分的银代表的是已通过血脑屏障的银。

表1 受池中银含量数据Table 1 Silver content in acceptor champer

首先根据表1的结果比较相同剂量下纳米银组和微米银组通过BBB模型的银含量的差别，结果显示，纳米银组通过血脑屏障的银显著高于微米银组(图2)，而微米银组与对照组之间无显著性差异。

然后再进一步比较不同剂量的纳米银通过血脑屏障的银含量之间的差异，图3显示了通过血脑屏障的银含量随纳米银剂量变化的曲线。由图可以看出，当纳米银剂量小于100μg·mL-1时，通过BBB的纳米银百分比变化不大，基本维持在2%左右。但当纳米银剂量达到100μg·mL-1后，随着纳米银剂量的增加，通过BBB的纳米银百分比也不断增大，当剂量达到400μg·mL-1时，已有约15%的纳米银通过了血脑屏障。

2.2 体外BBB模型超微结构的观察

图4显示了对照组和微米银组血脑屏障模型的超微结构照片，由图可以看出，两组血脑屏障模型中，构成主要屏障功能的脑血管内皮细胞之间的紧密连接结构完整、连接紧密，这显示微米银的加入并没有破坏血脑屏障。

图5显示了不同剂量下纳米银对血脑屏障超微结构的影响。当剂量较低时(25μg·mL-1)，和微米银组、对照组相似，构成主要屏障功能的脑血管内皮细胞之间的紧密连接结构完整、连接紧密(图5a)；但和其它两组不同的是，在内皮细胞中发现有外源性类圆形颗粒，直径与所使用的纳米银颗粒相近(图5b)，而这在对照组和微米银组内皮细胞中均未有发现，推测是纳米银颗粒进入了内皮细胞的内部。当剂量增加到100μg·ml-1后，BMVECs间的紧密连接依然紧密，但发现部分内皮细胞发生变性，出现坏死迹象，表现为细胞内出现一些空泡，显示有细胞器坏死(图5c)，在内皮细胞中发现有外源性类圆形颗粒，直径与所使用的纳米银颗粒相近(图5d)，推测是纳米银颗粒进入了内皮细胞的内部。随着剂量进一步增大 (200μg·mL-1)，可以看出血脑屏障中，大量的BMVECs坏死，BMVECs间的紧密连接明显被破坏，出现了较大的空隙 (图5e)。当剂量增大到400μg·mL-1时，在血脑屏障中已很难找到BMVECs，说明BMVECs已基本坏死，此时血脑屏障已完全被破坏，屏障功能基本消失(图5f)。

3 讨 论

从解剖学角度来看，血脑屏障包括脑毛细血管内皮细胞及其细胞间的紧密连接、周细胞、基膜和包绕在毛细血管外周的星形胶质细胞脚板、狭窄的细胞外间隙及其间的基质。构成屏障作用的主要是脑毛细血管内皮细胞。由于其膜上无窗孔，缺少收缩性蛋白，胞饮小泡极少，细胞内含有丰富的酶系统,细胞间存在复杂的紧密连接(tight juncture，TJ)，故它可阻止多种物质入脑，同时又选择性地转运多种营养物质和代谢产物[12]。

本课题在已有研究的基础上，采用原代培养大鼠脑毛细血管内皮细胞和星形胶质细胞共同培养的方法建立体外BBB模型，以模拟体内BBB中脑毛细血管内皮细胞的细胞特性，并通过跨膜电阻值的测定来验证模型的完整性，为研究纳米银颗粒通过BBB提供稳定的实验工具。

在建立体外血脑屏障模型的基础上，本研究进行了纳米银颗粒通过血脑屏障的剂量-效应关系的研究。结果显示，纳米银颗粒通过血脑屏障存在剂量－效应关系。实验结果显示，当纳米银剂量小于100μg·mL-1时，通过BBB的纳米银百分比变化不大，基本维持在2%左右。但当纳米银剂量达到100 μg·mL-1后，随着纳米银剂量的增加，通过BBB的纳米银百分比也不断增大，当剂量达到400μg·mL-1时，已有约15%的纳米银通过了血脑屏障。即当纳米银颗粒剂量在 100～400μg·mL-1的范围内时，随纳米银颗粒剂量增加，纳米银颗粒通过血脑屏障的比率也会相应增加。

对血脑屏障超微结构的进一步观察，解释了纳米银颗粒通过血脑屏障存在这种剂量-效应关系的原因。当纳米银颗粒剂量大于100μg·mL-1之后，血脑屏障中的脑毛细血管内皮细胞出现了大量的坏死，构成BBB主要屏障功能的脑血管内皮细胞之间的紧密连接也随着内皮细胞的坏死而被破坏，出现了明显的间隙。因此，可以推断，当纳米银颗粒剂量大于100μg·mL-1后，纳米银颗粒对BMVECs的细胞毒性是导致纳米银颗粒通过的一个主要原因，称之为“细胞毒性机理”。

当纳米银颗粒的剂量小于100μg·mL-1时，依然发现有约2%左右的纳米银可以通过BBB。但超微结构的观测结果显示此时构成BBB主要屏障功能的脑血管内皮细胞之间的紧密连接结构完整，连接紧密，即使小如纳米级颗粒，依然不可能通过这种紧密连接而通过血脑屏障，那这2%的纳米银是怎样通过BBB的了？此时通过对BBB超微结构放大观察可以发现，BMVECs中存在很多纳米银颗粒。如果把这一发现和只有纳米银颗粒可以通过血脑屏障的结果联系起来，可以做出一个推测，纳米银颗粒可以进入内皮细胞内部而微米银颗粒不能进入正是纳米银颗粒和微米银颗粒通过血脑屏障能力有差异的根本原因。也就是说剂量小于100μg·mL-1时，纳米银颗粒通过血脑屏障的机理是脑毛细血管内皮细胞的胞吞转运，即纳米银颗粒首先被血管内皮细胞吞噬到细胞内部，然后通过内皮细胞的胞吐作用从另外一侧吐出内皮细胞，使纳米银颗粒通过血脑屏障，我们称这种纳米银颗粒通过血脑屏障的方式为 “细胞转运机理”。

综上所述，可以发现在本研究的试验条件下，纳米银颗粒可以通过“细胞毒性机理”和“细胞转运机理”通过血脑屏障，纳米银颗粒通过血脑屏障很有可能是两种机制共同作用的结果。在剂量较低时，纳米银颗粒主要通过“细胞转运机理”通过血脑屏障，当剂量大到足以对BMVECs产生足够的细胞毒性时，“细胞毒性机理”将起主要作用。但是，在本研究中，因为使用的透射电镜没有配备EDS(energy dispersive spectrometer)检测配件，所以没能在观测内皮细胞超微结构的同时，检测在纳米银组内皮细胞中发现的外源性类圆形颗粒(图5b和图5d)的化学组成，仅只通过和对照组与微米银组透射电镜图片的比较，来推断这些外源性类圆形颗粒是纳米银颗粒。

因此本研究对纳米银通过血脑屏障的能力和机理仅只能做初步推测，需要进一步的元素分析和分子生物学研究加以验证。然而，本研究的结果提示，在临床使用含纳米银颗粒的医疗产品时，即使剂量很小，纳米银颗粒也存在通过血脑屏障的风险。因此，必须在进行充分的风险评估基础上[13-14]，再决定是否使用纳米银医疗产品。

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