人表皮活性因子柔性纳米脂质体的制备及相关性质研究

唐 冰 ，唐宁宁

(1.中国人民解放军成都军区昆明总医院药剂科，云南 昆明 650032;2.中国人民解放军77200部队，云南 昆明 650032)

表皮活性因子(EGF)是相对分子质量为6 216的活性多肽，由53个氨基酸组成，是人体重要的活性蛋白多肽物质之一，可促进受损表皮的修复与再生，对烧伤、烫伤、光疗等多种表皮创伤的修复功效十分显著，同时还可修复肠胃道、肝脏和眼角膜的损伤等。但EGF在局部使用过程中，很容易降解失活，极大地影响了其疗效，故需要采用适当的剂型提高其稳定性。柔性纳米脂质体，又称传递体(transfersomes)，它是在普通脂质体中加入表面活性成分，使脂质体具有柔韧性和变形性，不仅能提高所包载活性成分的稳定性，还能通过水合作用，提高活性成分的透皮吸收效果。利用柔性纳米脂质体制备技术对EGF进行改造，可以提高EGF的稳定性，促进EGF的吸收，延长EGF的释放作用时间，从而更好地发挥EGF的治疗作用。

1 仪器与材料

Avestin EF－C5型高压均质挤出机(加拿大);RE－5220型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);JY92－Ⅱ型超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司);Malvern Zetasizer nano ZS90型电位粒径测试仪(英国);JEM－1010型透射电镜(日本)，Thermo LL3000型冷冻干燥机(德国);Biotek酶标仪(美国)。氢化大豆磷脂(日本日油株式会社，纯度98%);胆固醇(天津市大茂化学试剂厂);去氧胆酸钠(天津市大茂化学试剂厂);甘露醇(上海实验试剂有限公司);维生素E(Sigma);氯仿(无锡市展望化工试剂有限公司);EGF(上海华源生命科学研究开发有限公司，规格为1×106IU/mg);EGF酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(Bluegene公司，货号为 E01E0216，灵敏度为 1.0 ng/mL);TritonX －100(北京鼎国生物技术有限责任公司，Lot87700150，＞99%);水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 制备(逆相蒸发法)[1]

精密称取大豆磷脂、胆固醇和维生素E，置梨形瓶中，加入适量氯仿(含1%无水乙醇)，于4℃水浴中溶解脂质。取甘露醇、胆酸钠和EGF溶解于4℃ PBS(pH=7.4)溶液中。脂质溶解后，将PBS溶液倒入脂质溶液中，在水浴式超声仪中(低于10℃)超声10min(超声10 s，停5 s)，形成均匀乳液。室温下放置30min。将乳液于旋转蒸发仪上减压蒸发(负压0.07 MPa，转速500 r/min)，形成水相脂质体混悬液后，继续蒸发15min，以彻底去除有机溶剂。再在水浴式超声仪中(低于10℃)超声10min(超声10 s，停5 s)。将脂质体混悬液转移高压均质挤出机中，高压均质3次，再通过0.1μm微孔滤膜挤出10次后，－40℃预冻24 h后，于冷冻干燥机中制备成冻干粉末。

2.2 EGF含量检测[酶联免疫吸附法(ELISA)]

分别配制质量浓度为 15，30，50，100，200，300，400，500 ng/mL的EGF系列溶液，以0.2%TritonX－100破坏脂质膜的空白柔性纳米脂质体做空白对照，按照EGFELISA检测试剂盒说明书的方法和步骤检测样品，以样品中EGF的质量浓度(X)为横坐标、检测的OD值(Y)为纵坐标，采用四参数回归方法进行运算，得回归方程 Y=(A－D)/[1+(X/C)^B]+D，以检测样品中EGF的含量。

2.3 脂质体分离

采用由Fry等[2]提出的Sephadex G－50微柱离心法分离柔性纳米脂质体和游离EGF。将Sephadex G－50用适量PBS溶液浸泡24 h后装柱，以3 000 r/min离心3min以去除其中多余的PBS，先用不含EGF的空白柔性纳米脂质体0.25mL过柱，然后向柱中加入0.25 mL EGF柔性纳米脂质体混悬液，离心，收集离心液，脂质体就和仍然滞留于柱中的游离药物分离。

2.4 相关性质研究

柔性纳米脂质体径1.0%磷钨酸负染，于透射电镜下观察其形态;将柔性纳米脂质体用PBS缓冲液稀释10倍，在室温下用粒径和电位分析仪测定其粒径和电位;包封率(EE)采用以下公式计算:EE(%)=柔性纳米脂质体EGF含量/柔性纳米脂质体混悬液中EGF总含量×100%;载药量:取EGF冻干脂质体1mg，置5 mL容量瓶中，加入0.2 mL 10%TritonX－100，加PBS至刻度，测定总EGF量;冻干脂质体载药量=EGF的量/1mg×100%。本方法所制备的EGF柔性纳米脂质体为多室脂质体，见图1。其平均粒径为(81.62±3.67)nm，Zeta电位为(60.12±7.58)mV，平均包封率为(37.86 ±4.77)%，平均载药量为(6.58 ±1.27)%。

图1 EGF柔性纳米脂质体透射电镜图

2.5 变形性考察

取1mL一次性注射器，分别加入1mL蒸馏水、EGF柔性纳米脂质体及 EGF 普通脂质体，分别外加 0.1，0.2，0.3，0.4 和 0.5MPa压力，计算样品完全通过100 nm一次性微孔滤膜的时间，计算样品通过时间与蒸馏水通过时间之比，以考察柔性纳米脂质体的变形性。结果见表1。经 t检验，P＜0.01，表明与普通EGF脂质体相比，EGF柔性纳米脂质体具有极显著的变形性。

表1 EGF柔性纳米脂质体变形性试验结果

2.6 稳定性考察

取3批EGF脂质体混悬液、EGF冻干粉及EGF脂质体冻干粉，分别置室温、4℃条件下，于0，3 m测定其包封率、载药量、pH、粒径和Zeta电位，并观察外观，以确定其稳定性。结果见表2。

表2 样品放置3个月后稳定性结果(n=3)

3 讨论

采用逆相蒸发法制备水溶性成分脂质体具有较高的包封率，在旋转蒸发过程中，应注意控制真空负压，以防止影响脂质体形成和包封率的泡沫产生。EGF对热稳定性较差，整个制备操作应在较低温度下进行(4℃)，同时，如同其他脂质体一样，在制备过程中应严格控制磷脂氧化产物的生成(如加入适量的维生素E)，以防产生溶血反应[3]。

在运用柱层析进行TF的分离时，由于在Sephadex G－50表面存在着能与脂质体膜结合并相互作用的微小部位。虽然这种作用并不影响脂质体在凝胶柱上的流动特征，但仍可导致少量脂质体的损失，使膜的不稳定性增加，从而导致膜渗透性的改变及包裹物质的渗漏，故需用空白脂质体预先将柱子饱和来解决[4]。但也需注意上柱量不宜太大，否则会产生TF拖尾现象。

在稳定性预试验过程中发现，EGF溶液无论是在室温还是在4℃条件下，其稳定性极差，12 h失活率超过80%。因此，稳定性试验选择脂质体混悬液、脂质体冻干粉和EGF冻干粉。结果显示，将EGF制备成脂质体或冻干粉末，都可提高其稳定性，但在室温条件下放置3个月，EGF脂质体混悬液或冻干粉的包封率或载药量降低40%以上，而EGF脂质体冻干粉可显著提高其稳定性。

由变形性试验结果可知，柔性纳米脂质体较普通脂质体具有显著的可变形性，且其随外力增加而增加，其表现出的良好变形性及对所包裹活性成分稳定性的提高，是其作为药物透皮给药载体的基础，因此柔性纳米脂质体可能成为透皮转运的有效载体。

[1]Taylor G，Kellaway IW，Steven J.Drug entrapmentand release from multilamellar and reverse phase evaporation liposomes[J].Int JPharm，1990，58(1):49－55.

[2]Fry DW，White JC，Goldman ID.Rapid separation of low molecular weight solutes from liposomes without dilution[J].Anal Biochem，1978，90(2):809－815.

[3]翁帼英，陈明非.脂质体中卵磷脂的氧化产物与溶血的关系[J].生物化学与生物物理进展，1990，17(1):76.

[4]平其能.现代药剂学[M].北京:中国医药科技出版社，1998:607.