反相高效液相色谱法测定灯盏细辛中灯盏乙素含量

聂朝霞

(湖南省衡阳市妇幼保健院药剂科，湖南 衡阳 421001)

灯盏花素(Breviscapine)是从菊科短莛属灯盏细辛中提取分离的黄酮类有效成分，主要成分为灯盏乙素(Scutellarin)，化学名为4’，5，6－三羟基－甲酮－7－葡萄糖醛酸苷，具有扩张微血管、增加动脉流量、降低血液黏度、减少外周阻力、抑制血小板聚集等作用[1]，临床用于治疗冠心病、心绞痛、心肌缺血损伤、血栓形成等[2]。本研究建立了灯盏细辛中灯盏乙素的分析方法，可作为灯盏细辛质量控制的方法。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪(美国Waters公司，包括Waters2996二极管阵列检测器，515型高压泵，Waters717自动进样器，Empower Pro色谱工作站);AllegraTM X－ZZR Centrifuge冷冻离心机(贝克曼公司);UV－260型紫外分光光度仪(日本岛津公司);BA110S型电子分析天平(德国);KQ－300DE型数控超声仪(昆山市超声仪器有限公司)。灯盏乙素对照品(中国药品生物制品检定所，批号为842－200102);灯盏细辛药材(湖南衡阳瑞源医药公司);甲醇为色谱纯(美国Fishers公司)，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Hypersil C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm);柱温:30℃;流动相:甲醇 －水(1∶1，1mol/L磷酸调节 pH至2.5);流速:1mL/min;检测波长:335 nm;柱温:35℃。进样量:10μL。理论板数按灯盏乙素计算应不低于3 000，此条件下，灯盏乙素(tR=8.3min)与相临色谱峰分离度大于1.5，见图1。

图1 高效液相色谱图

2.2 溶液制备

精密称取灯盏乙素对照品8mg，置100mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，得灯盏乙素标准贮备液(80μg/mL)，避光4℃冰箱保存，临用时将贮备液用流动相稀释至所需浓度，即得对照品溶液。精密称取药材粉末(过50目筛)0.5 g，置具塞锥形瓶中，加入蒸馏水25mL，密塞，称定质量，超声处理(300W，40 kHz)45min，放冷，密塞，再称定质量，用蒸馏水补足减失的质量，摇匀，滤过，以15 000 r/min的速度离心15min，精密量取续滤液1mL置10mL棕色容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察:分别精密吸取灯盏乙素对照品溶液(20μg/mL)0.125，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0mL 置 10mL 容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，按上述色谱条件依次进样10μL，测定。记录峰面积，以峰面积积分值(Y)为纵坐标、质量浓度(X)为横坐标进行线性回归，得回归方程 Y=2.54 ×104X+612.86，r=0.999 9。结果表明，灯盏乙素质量浓度在0.25～8.00μg/mL范围内与峰面积呈良好线性关系。

精密度试验:精密吸取对照品溶液的稀释液(2.0μg/mL)，按拟订色谱条件连续进样5次。结果灯盏乙素峰面积的 RSD为0.59%(n=5)，表明仪器精密度良好。

重复性试验:精密称取同一批样品，按2.2项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样6次，依法测定。结果灯盏乙素平均含量为 1.79 mg/g，RSD 为 0.99%(n=6)，表明该试验重复性良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，在拟订色谱条件下，分别于0，1，2，4，8，12，24 h 时进样测定。结果灯盏乙素峰面积的 RSD 为0.82%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

加样回收试验:精密称取已知灯盏乙素含量的药材粉末9份，每份0.5 g，分别精密加入灯盏乙素对照品溶液，按2.2项下方法制备供试品溶液，并按拟订色谱条件进行含量测定，计算回收率。结果平均回收率为99.8%，RSD为1.1%(n=9)。

2.4 样品含量测定

按2.2项下方法制备各不同来源的灯盏乙素的供试品溶液，按拟订色谱条件进行反相高效液相色谱分析，按外标法计算各收集的灯盏细辛中灯盏乙素的百分含量，见表1。

表1 灯盏细辛中灯盏乙素含量测定结果

3 讨论

根据测定目标表化合物灯盏乙素的理化性质和文献，分别考察提取溶剂(95%乙醇、甲醇、水)、提取方式(回流、超声提取)、溶剂量、提取时间，确定最佳提取条件为:以50倍量乙醇超声提取45min。此方法简便易行，灯盏乙素提取率最高，测定时干扰物质少。

根据文献资料，参考灯盏乙素含量测定方法。选择了3种色谱柱:Kromasil C18柱(200 mm ×4.6 mm，5μm);Hypersil ODS柱(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱;DiamonsilC18柱(250mm×4.6mm，5 μm)色谱柱。分别选用 0.01% ，0.035% ，0.05% 的磷酸溶液与甲醇组成(甲醇－磷酸溶液=50∶50)3种流动相进行试验比较，结果以甲醇－0.035%磷酸溶液(50∶50)为流动相时分离度、灯盏乙素的峰形好，故选用甲醇－0.035%磷酸溶液(50∶50)为流动相。流速为1.0mL/min，柱温为35℃，检测波长为335 nm时，供试品中灯盏乙素得到了较好的分离，理论板数不低于3 000，分离度大于 1.5。

取一定量已知质量浓度的灯盏乙素对照品溶液，于190～700 nm波长范围内扫描，结果在335 nm波长处有最大吸收，确定335nm为测定波长。

对不同产地的灯盏细辛样品中灯盏乙素含量进行比较，发现不同的产地之间差异较大。这与杨生超等[3]的研究结果基本一致，可能在灯盏细辛的自然选择过程中发生了遗传分化有关。鉴于文献报道灯盏细辛中灯盏乙素有较好改善心脑血管疾病的作用，故将灯盏乙素的含量作为药材品质评价指标之一。本研究为灯盏细辛药材及制剂质量控制提供了依据。

[1]程 英，陈 鑫，朱志安，等.灯盏花素对大鼠脑挫裂伤脑组织线粒体ATP酶活性及SOD和MDA水平的影响[J].上海中医药大学学报，2004，18(2):58 －60.

[2]陈新谦，金有豫.新编药物学[M].第14版.北京:人民卫生出版社，1997:277.

[3]杨生超，张雪峰，李 黎，等.灯盏花种质资源灯盏乙素和咖啡酸醋含量[J].中国中药杂志，2009，34(2):239 －240.