连花清瘟胶囊超声逆流提取液超高效液相色谱指纹图谱研究＊

李正杰，靳茂礼，张永锋，粘立军，武景路，刘敏彦

(1.石家庄以岭药业股份有限公司，河北 石家庄 050035;2.石家庄市食品药品检验所，河北 石家庄 050035)

连花清瘟胶囊系石家庄以岭药业股份有限公司自主研发并获得国家专利的新药，临床证实其在防治SARS、禽流感、手足口病、甲型H1N1流感等严重公共卫生事件中显示出了良好的效果[1－3]。采用传统的乙醇回流提取工艺，提取溶剂用量大，生产成本高，故采用连续超声逆流提取技术对原工艺进行了优化和提升，并采用超高效液相色谱(UPLC)法建立超声逆流提取液的指纹图谱[4－5]，为连花清瘟胶囊超声逆流提取液质量控制标准的建立和评价提供依据。

1 仪器与试药

Acquity UPLCHclass超高效液相色谱仪(美国Waters公司)，包括四元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、Empower3色谱工作站;AT201型1/10万分析天平(瑞士 Mettlertoledo公司);Milli－QAdvantage A10超纯水系统(millipore)。磷酸(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号为20120211);乙腈(色谱纯，美国Fisher公司);水为超纯水，其他试剂均为分析纯。连花清瘟胶囊超声逆流提取液(批号分别为S1:120327，S2:120401，S3:120402，S4:120403，S5:120404，S6:120405，S7:1200406，S8:120407，S9:120408，S10:120409，S11:120410);连翘酯苷A(批号为111810－201102)、连翘苷(批号为110821－201112)、大黄酸(批号为110757－200206)对照品均购于中国食品药品检定研究院;松脂素－4－O－glc对照品为自制，经高效液相色谱分析纯度大于95%。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:AcquityUPLC® BEHC18柱(100mm×2.1mm，1.7μm);检测波长:228nm;进样量:0.4μL;柱温:40℃;流动相:乙腈 －0.1%磷酸溶液梯度洗脱，见表1。

表1 流动相梯度洗脱表

2.2 溶液制备

分别取连翘酯苷A、连翘苷、松脂素－4－O－glc、大黄酸对照品适量，精密称定，用甲醇配制成含连翘酯苷A 0.12 g/L、连翘苷 0.13 g/L、松脂素 －4－O －glc 0.09 g/L、大黄酸 0.10 g/L 的对照品溶液。按处方量取麻黄、连翘、大黄、鱼腥草，加70%乙醇，浸泡20min，超声逆流提取，取超声逆流提取液，用0.22μm滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

精密度试验:取同一样品(批号为120327)的供试品溶液在拟订色谱条件下重复进样6次，记录指纹图谱。结果各色谱峰的相对保留时间的 RSD＜1.1%，相对峰面积的 RSD＜2%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:吸取同一供试品溶液，分别于 0，2，6，12，24 h 时进样，测定峰面积。结果各色谱峰的相对保留时间的 RSD＜1.2%，相对峰面积的 RSD＜1.8%。综合分析，超声逆流提取液在常温下24 h内稳定。

重复性试验:取同一样品6份，依法制备供试品溶液，进行指纹图谱分析。结果各色谱峰的相对保留时间的 RSD＜1.4%，相对峰面积的 RSD＜2.1%，表明该方法重复性良好。

2.4 指纹图谱的建立与相似度分析

指纹图谱建立:取11批超声逆流提取液，进行UPLC指纹图谱测定，得相应的指纹图谱，见图1。并采用国家药典委员会开发的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件对11批样品的指纹图谱进行分析，以S6为参照指纹图谱(图2)，采用平均数相关系数法对各指纹图谱色谱峰进行多点校正和自动匹配，其中共有色谱峰27个，用标准品指认了其中4个共有峰，分别为连翘酯苷A(8号峰)、连翘苷(17号峰)、松脂素－4－O－glc(10号峰)、大黄酸(24号峰)，以出峰稳定，峰面积较大的17号色谱峰－连翘苷为参照峰。

图1 11批连花清瘟胶囊超声逆流提取液UPLC指纹图谱

图2 连花清瘟胶囊超声逆流提取液UPLC参照指纹图谱(S6)

指纹图谱相似度分析:将11批超声逆流提取液的UPLC指纹图谱导入国家药典委员会2004年版“计算机辅助相似度评价系统”软件中，并以S6为参照指纹图谱(图2)，采用平均数相关系数法对各指纹图谱色谱峰进行了多点校正和自动匹配，生成连花清瘟胶囊超声逆流提取液共有模式的对照指纹图谱(R)，然后进行了相似度计算，11批超声逆流提取液指纹图谱与对照指纹图谱的相似度见表2。

3 讨论

表2 11批超声逆流提取液指纹图谱相似度表

对供试品溶液进行光谱检测，比较各波长下的UPLC图谱，发现采用228 nm进行测定时，所得连花清瘟胶囊超声逆流提取液所得图谱信息量大，且峰值分布最合理，故确定波长为228 nm。

分别考察了超声逆流30，45，60min时的样品色谱图，结果表明，超声逆流45，60min样品色谱图中出峰相差不大，且峰面积较30min大，故超声逆流时间确定为45min。

本试验通过对超声逆流提取液的研究，建立超声逆流提取数据库，利用UPLC快速检测技术，实现了超声逆流提取液的在线监测，通过检测结果，监控超声逆流提取过程，为保证不同批次产品之间的稳定，提供了参考数据，实现了节能生产、高效生产。

[1]刘更新，张艳霞，杨继清，等.连花清瘟胶囊治疗甲型H1N1流感随机对照临床研究[J].疑难病杂志，2010，9(1):91－92.

[2]王新功，崔学军，刘新生，等.连花清瘟胶囊治疗流行性感冒的临床疗效观察[J].中国药房，2008，19(27):2 146.

[3]赵 迪，晏建新.连花清瘟胶囊治疗手足口病133例临床疗效分析[J].中医中药，2011，9(31):388.

[4]张 琦，王振中，萧 伟，等.茯苓UPLC特征指纹图谱研究[J].中国中药杂志，2012，37(7):966.

[5]张 琦，王振中，萧 伟，等.白芍药材UPLC特征指纹图谱研究[J].中国中药杂志，2011，36(6):712.