四物口服液对羟基自由基的清除作用

胡大强，傅若秋，卢来春，宋宏宇，徐 靖，向明凤

(中国人民解放军第三军医大学第三附属医院药剂科，重庆 400042)

四物口服液是依据四物汤组方，采用现代制剂工艺生产的中成药口服液。四物汤源自宋代《太平惠民和剂局方》，是补血养血、活血调经之经典方剂，由熟地黄、白芍、当归、川芎4味中药组方，当归、熟地黄为君药，临床用于治疗盆腔炎、肾炎、肩周炎等[1]。本研究中采用荧光分光光度法评价四物口服液体外对羟基自由基的清除作用，观察到四物口服液具有体外清除致炎分子自由基的作用[2]，现报道如下。

1 仪器与试药

ZF－I型三用紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂);培养皿(外径80 mm);BS124S型电子分析天平(Sartorious);F－2500型荧光分光光度计(Hitachi，Tokyo Japan)。苯甲酸(分析纯，重庆川东化工有限公司，批号为20080812);30%过氧化氢(成都科龙化工试剂厂，批号为20110219);四物口服液(批号为100715)和纯化水均由第三军医大学第三附属医院药剂科提供。

2 方法与结果

2.1 样品测定

取22mmol/L的过氧化氢溶液1.00mL，分别加入不同稀释倍数的系列样品溶液2.00 mL，置外径80 mm培养皿中混匀，254 nm紫外光照射25min，分别加入0.80mol/L苯甲酸3.30mL混匀，室温放置5min，在激发波长304 nm、发射波长401 nm条件下测定荧光强度。

2.2 荧光检测条件的确定及试验可行性分析

在外径80 mm培养皿中加入22 mmol/L过氧化氢溶液1.00mL和纯化水 2.00mL，在 254 nm 紫外光下照射 25min，加入 0.80mol/L苯甲酸 3.30mL，室温放置 5min，即得试样 1;在外径80mm培养皿中加入纯化水3.00mL，在254 nm紫外光下照射 25min，加入 0.80mol/L 苯甲酸 3.30mL，室温放置 5min，即得试样2;精密吸取四物口服液1.00mL置100 mL容量瓶中，加纯化水至刻度定容，摇匀，精密吸取上述液2.00 mL置外径80mm培养皿中，再加纯化水1.00mL，摇匀，在254 nm紫外光下照射 25min，加入 0.80mol/L 苯甲酸 3.30mL，室温放置 5min，即得试样3。

固定测定荧光测定参数，分别对上述3种试样进行荧光扫描，得荧光图谱，见图1。试样1的最大激发波长为304 nm，最大发射波长为401 nm。在激发波长304 nm和发射波长401 nm处测定，试样1有较高荧光强度，试样2和试样3则与基线接近。因此，选择激发波长304 nm和发射波长401 nm作为荧光检测波长用于四物口服液对羟基自由基的清除作用评价。

图1 荧光发射光谱图

2.3 苯甲酸溶液浓度的选择

吸取1.00mL过氧化氢溶液(20mmol/L)置5个外径80mm培养皿中，254 nm紫外光下照射25min，分别加入3.30mL不同浓度苯甲酸溶液并摇匀，放置5min后，测定荧光强度，结果见表1，荧光强度随苯甲酸浓度增加而增加，浓度超过0.80mmol/L时，荧光强度趋于稳定。

表1 苯甲酸溶液浓度选择

2.4 紫外光照射时间对羟基自由基产生的影响

吸取 3.30mL 苯甲酸溶液(0.80mmol/L)和 1.00mL 过氧化氢溶液(22mmol/L)置外径80mm培养皿中，混匀，在254 nm紫外光下照射不同时间，测定荧光强度，结果见表2。由表2可知，照射25min后溶液荧光强度最大，再增加紫外光照射时间荧光强度无显著变化。因此，选定紫外光照射时间为25min。

表2 紫外光照射时间对羟基自由基产生的影响

2.5 过氧化氢线性范围的确定

吸取1.00 mL不同浓度过氧化氢溶液于5个外径80 mm培养皿中，置254 nm紫外光下照射25 min，分别加入3.30 mL苯甲酸溶液(0.80 mmol/L)，室温放置5 min，测定荧光强度，结果见表3。

表3 过氧化氢浓度的选择

2.6 样品测定结果

按2.1项测定四物口服液清除羟基自由基的 IC50(荧光强度降低50%时药物浓度)为0.009 3倍原药，结果见表4。

表4 四物口服液清除羟基自由基的能力

3 讨论

基于不同浓度的四物口服液对羟基自由基的清除能力不同和苯甲酸的荧光强度极低，在测定四物口服液对羟基自由基清除率时，需向体系中加入不同稀释倍数药物，反应后溶液中剩余的羟基自由基量不等，向溶液中加入过量苯甲酸，保证溶液中羟基自由基与苯甲酸反应完全，检测产物的荧光强度才能准确反映四物口服液清除羟基自由基的能力。

试验观察到 2.00 mL 20 mmol/L过氧化氢检测体系，0.01～0.80mmol/L苯甲酸 3.30mL条件下，反应体系荧光强度随苯甲酸浓度增加而增加，当浓度超过0.80mmol/L时，荧光强度不再变化。因为在超过3.30mL(0.80mmol/L)苯甲酸时，体系中羟基自由基的量已相对不足，苯甲酸不能都转变为强荧光物质。

[1]李 琼，李 萍，黄晓君.桃红四物汤加减综合治疗实性痛经疗效观察[J].辽宁中医杂志，2007，34(5):617 －618.

[2]赵淑杰，韩忠明，李彦颖，等.鹿药提取物清除羟基自由基的研究[J].华南农业大学学报，2010，31(2):59－62.