体外扩散池法评价银杏酮酯磷脂复合物体外透过性能研究

赖 乐，莫红缨，赖春丽

(广州医学院第一附属医院呼吸疾病研究所，广东 广州 510120)

银杏酮酯(GBE50)是从银杏叶中提取、精制而成，经国家食品药品监督管理总局批准正式生产的二类中药新药，主要成分是黄酮醇苷与萜类内酯，临床主要用于预防和治疗心脑血管疾病，但由于口服吸收差，影响临床应用，而磷脂复合物中的磷脂分子具有两亲性可作为有效的乳化剂，也是细胞膜的重要组成部分，因此，制备成银杏酮酯磷脂复合物，通过改善肠透过性能，为提高口服吸收利用度提供可能。体外扩散池法被国外学者誉为胃肠道屏障功能研究的金标准，在研究药物的肠吸收和代谢方面已有一定的应用，通过高效液相色谱(HPLC)法或分光光度法测定药物的透过量后，根据药物的有效渗透系数来评价药物吸收的动力学的变化，可用于研究药物在特定肠段的吸收，模拟肠道的生理环境，操作方便简单。本研究中的体外扩散池法试验是建立在大鼠肠黏膜基础上的，是用来预测银杏酮酯中的黄酮醇苷在人体的吸收，对银杏酮酯原料和银杏酮酯磷脂复合物进行体外初步评价，为提高银杏酮酯磷脂复合物在体内的生物利用度提供有利依据。

1 材料与方法

1．1 仪器与试药

LC-20A型系列高效液相色谱仪(日本岛津公司);7 mL Ussing Chamber装置(美国 Harvard公司);Model-868型 pH计(Thermo Orion);电子分析天平(sarorius，d=0．1 mg)。戊巴比妥钠(中国医药上海化学试剂厂);银杏酮酯(GBE50，上海杏灵科技药业公司，批号为061202);大豆磷脂(上海太伟药业有限公司，批号为20072101017);四氢呋喃(广州化学试剂厂，批号为030901-2);甲醇为色谱纯;槲皮素对照品(批号为100081-200406)、山柰素对照品(批号为110861-200606)、异鼠李素对照品(批号为110860-20046)均由中国药品生物制品检定所提供;磷酸(广州化学试剂厂，批号为20071003)。SD 大鼠[♂，250～280 g，南方医科大学实验动物中心，许可证号SCXK(粤)2006-0015]。

1．2 方法

1．2．1 银杏酮酯磷脂复合物的制备

按1∶1质量比称取银杏酮酯与大豆磷脂适量，溶于四氢呋喃中，反应温度为30℃，反应物质(银杏酮酯)的浓度为20 g/L，反应6 h后，40℃真空干燥去掉反应溶剂，用二氯甲烷洗涤未反应的原料，40℃真空干燥去掉二氯甲烷后，即得。

1．2．2 Hepes-Tris缓冲液的制备

精密称取Hepes 3．0 g，加入400 mL蒸馏水，搅拌使之完全溶解，通入混合气体(95%O2∶5%CO2)10 min后，加入 0．9 mL KCl(3 mol/L)，0．9 mL CaCl2(1 mol/L)，0．4 mL MgSO4(1 mol/L)和4．09 g NaCl，充分搅拌完全溶解后，用Tris液(1 mol/L)调节pH至7．4，加入 2．5 mL 葡萄糖(1 mol/L)，加入蒸馏水定容至 500 mL。

1．2．3 药物溶液的制备

由同一名口腔医生采用精度为0.01 mm的电子数显游标卡尺(深圳佳林)测量第一前磨牙的全牙长、冠长、根长、冠近远中径、冠唇(颊)舌径、颈近远中径和颈唇(颊)舌径，每个数据测量3次，取平均值。肉眼观察并记录各牙根数目，其中双根型包括根分叉位于根上、根中、根尖1/3处，且有独立根尖孔。

GBE50原料溶液:称取0．05 g GBE50溶于1 mL乙醇中，再取 0．5 mL用 Hepes-tris缓冲液定容至 50 mL作为供试液，GBE50的最终质量浓度为0．5 g/L。

GBE50磷脂复合物溶液:称取0．103 g GBE50磷脂复合物(相当于 GBE50 0．05 g)溶于 1 mL乙醇中，再取 0．5 mL用 Hepes-tris缓冲液定容至50 mL作为供试液，GBE50的最终质量浓度为 0．5 g/L。

杏灵颗粒溶液:称取0．625 g杏灵颗粒(1 g∶40 mg GBE50，相当GBE50 0．025 g)溶于0．5 mL乙醇，用 Hepes-tris缓冲液定容至50 mL作为供试液，GBE50的最终质量浓度为0．5 g/L。

1．2．4 体外扩散池法

选取SD大鼠禁食16～19 h，3%戊巴比妥钠(32 mg/kg)腹腔注射麻醉，沿腹中线将腹部切开2．5 cm左右，胃下5 cm处为空肠(约10 cm)，在空肠前端插入硅胶管(内径2 mm)结扎，空肠末端剪开一小口后，轻缓地用0．9%氯化钠注射液冲洗干净，分离空肠置HEPES缓冲液中，冰浴培养5 min，剪取3～4 cm长的肠段，迅速分离筋膜层，将肠黏膜固定于扩散池上。黏膜侧加入37．5℃试验用药物7 mL，浆膜侧加入等体积同温度的HEPES缓冲液;在混合气体(95%O2∶5%CO2)的作用及37．5℃水浴保温下，分别于 15，30，45，60，75，90，120 min 时在接收侧取样 0．5 mL，同时补充0．5 mL缓冲液。

1．2．5 银杏酮酯中黄酮醇苷的测定

标准曲线绘制:分别取在五氧化二磷减压干燥器中放置过夜的对照品槲皮素、山柰素、异鼠李素对照品适量，用甲醇溶解配制不同质量浓度，槲皮素质量浓度分别为 12．5，25，50，100，200 ng/mL，山柰素质量浓度分别为 8．75，17．5，35，70，140 ng/mL，异鼠李素质量浓度分别为 8．75，17．5，35，70，140 ng/mL。分别绘制标准曲线(X轴为质量浓度，g/L，Y轴为峰面积)，得回归方程，槲皮素为 Y=117．09X ＋324．94(R2=0．998 3);山柰素为Y=52．528 X ＋48．783(R2=0．999 9);异 鼠 李 素 为 Y=49．93 X ＋34．5(R2=0．999 5)。

空白干扰试验:取不含任何药液的透过液按2．5．2项下方法处理，由于透过液在368 nm波长处无吸收，因此不会对透过液中黄酮醇苷的测定产生干扰，见图1。

1．2．6 数据处理

将高效液相色谱法测得的数据用Excel软件进行处理，根据标准曲线得到的各个时间点的浓度(Ctn)，用下列公式计算累计样体积和加入药液量，单位为L。根据给药剂量 D，计算累计透过率:Qtn/D×100%。表观渗透系数(Papp)是表示药物经黏膜透过能力的重要指标，其计算公式为:Papp=(dQ/dt)×(1/AC0)，其中dQ/dt表示稳态时时间，累计透过量线性回归所得的斜率，A为有效渗透面积1．78 cm2，C0为加入药液时初始药物浓度。

2 结果

2．1 最佳区段肠的选择

图1 高效液相色谱图

分别选择十二指肠、空肠、回肠、结肠作比较，以各区段肠的累计透过率与时间作图，详见图2，而表观渗透系数比较见表1。用SPSS 13．0统计软件对各区段肠间的表观渗透系数进行组间one-way ANOVA分析，多重比较采用LSD法，各区段肠的表观渗透系数比较结果，十二指肠的Papp与其他3组相比都有显著性差异，空肠与回肠和结肠相比也有显著差异。Papp是评价透过性能的重要指标，说明十二指肠的透过性能最好，空肠次之，但由于药物在十二指肠的停留时间较短，则选用空肠为最佳区段肠。

图2 GBE50体外扩散池法试验透过图(n=3，X±s)

表1 GBE50在各区段肠的表观渗透系数

2．2 药物组间比较

分别取药液银杏酮酯原料药、银杏酮酯磷脂复合物和阳性对照药(杏灵颗粒)并比较三者在空肠的透过性能，以累计透过率与时间作图，详见图3，表观渗透系数比较见表2。用SPSS13．0统计软件对各组间的表观渗透系数进行组间one-way ANOVA分析，多重比较采用LSD法，各组的表观渗透系数比较结果，与GBE50原料组比较，GBE50磷脂复合物组与阳性对照组均有显著差异，且均有提高;阳性对照与GBE50磷脂复合物比较，也有显著差异，Papp也有提高，透过性能也有所改善。

图3 GBE50体外扩散池法试验透过曲线图(n=3，X±s)

表2 GBE50在空肠的表观渗透系数

3 讨论

体外扩散池法用来评价银杏酮酯磷脂复合物的透过性能，用高效液相法测定肠黏膜通过的黄酮醇苷的量，该方法灵敏度较高，重现性较好，而且该方法测定黄酮醇苷比较成熟，因此，选择用高效液相色谱法测定黄酮醇苷的含量作为评价透过性能的指标。

在体外扩散池试验中要注意控温和通气，防止肠变性，氧化，失去正常活性，在选择溶剂时，用乙醇作为助溶剂能使药物更好地溶解，但乙醇的浓度不超过1%，以防止破坏肠的活性，且要保证各溶液的乙醇的浓度一致，以减少误差。

在选择最佳区段肠时，选取了十二指肠、空肠、回肠、结肠进行透过性能的比较，结果十二指肠较其他区段肠透过性能都好(P＜0．01)，但由于药物在十二指肠的停留时间较短，因此选择此肠段没有实际意义，而黄酮醇苷在空肠的透过性能仅次于十二指肠，较其他肠段(回肠，结肠)透过性能好(P＜0．01)，因此最后选择空肠为最佳评价肠段。

体外扩散池法试验结果表明，银杏酮酯磷脂复合物的透过性能较其他两组都有所改善(P＜0．01)，可能原因为银杏酮酯磷脂复合物的脂溶性增加，改善了溶解性能和黏膜透过性能，从而增加了肠透过性能。

至今为止，超过60%的药物为口服制剂，因此预测药物经胃肠道黏膜吸收在设计口服给药剂型非常重要并具有实际价值[3]。Watanabe等[4]通过体外扩散池法试验对15种水溶性和脂溶性的药物表观渗透系数进行测定，并与人体内吸收分数(Fa)比较相关性，结果表明Papp与Fa之间存在良好的相关性。本研究对银杏酮酯磷脂复合物、银杏酮酯原料与杏灵颗粒的Papp进行测定，结果相比其他两组，银杏酮酯磷脂复合物的Papp有所增加，表明银杏酮酯制备成磷脂复合物后，有可能提高人体内的吸收度，从而提高生物利用度。

[1]赖 乐，赖春丽，赵建彬，等．银杏酮酯磷脂复合物的制备与理化性质的研究[J]．中药材，2010，33(10):1 624-1 628．

[2]国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)[M]．北京:化学工业出版社，2005:220-221．

[3]李国峰，王春霞，晏 媛，等．体外扩散池法评价瑞巴派特经大鼠肠黏膜的透过特性[J]．药学学报，2008，43(3):314-317．

[4]Watanabe E，Takahashi M，Hayashi M．A possibility to predict the absorbability of poorly water-soluble drugs in humans based on rat intestinal permeability assessed by an in vitro chamber method[J]．Eur J Pharm Biopharm，2004，58:659-665．