顶空气相色谱法检测依诺肝素钠原料药中有机溶剂残留

2013-09-14马光磊俞孝珍

中国药业 2013年14期

马光磊，俞孝珍

(杭州九源基因工程有限公司，浙江杭州 310018)

依诺肝素钠(enoxaparin sodium)系从猪肠黏膜提取的肝素钠苄酯衍生物经碱裂解而得的低分子量肝素钠盐，已广泛用于预防深静脉血栓、治疗血栓形成和血液透析抗凝[1－2]。在依诺肝素钠的生产过程中用到了甲醇、乙醇、二氯甲烷等有机溶剂，药物中有机溶剂的残留若大于一定限度，对人体会有危害，因此《中国药典》对各有机溶剂的限量均有规定，甲醇、乙醇、二氯甲烷分别为0.3% ，0.5%，0.06%[3]。本研究中采用顶空气相色谱法建立了依诺肝素钠原料药中残留溶剂的测定方法，报道如下。

1 仪器与试药

6890 型全自动气相色谱仪(Agilent公司)，氢离子火焰检测器)。依诺肝素钠原料(杭州九源基因工程有限公司);甲醇、乙醇、二氯甲烷均为市售分析纯试剂，水为18 Ω纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Agilent HP－5毛细管色谱柱(30 m×0.32 mm，0.5 μm);载气:高纯氮气(纯度不低于 99.99%);检测器:FID;柱流速:1.0 mL/min;气化室温度:200℃;检测器温度:250℃;氢气流速:40.0 mL/min;空气流速:不低于400 mL/min;柱温:30℃(5 min，40℃ /min)→120℃;分流比:1∶1。顶空加热温度:85℃;平衡时间:20 min;进样环温度:100℃;传送带温度:110℃;进样体积:顶空瓶上部气体1 mL，自动顶空进样。

2.2 溶液配制

定位溶液:分别精密吸取甲醇10 μL，乙醇25 μL，二氯甲烷2 μL，置 100 mL 容量瓶中，加水至 100 mL，摇匀，即得。

限量对照溶液:精密吸取甲醇(相对密度0.79)10 μL，乙醇(相对密度 0.79)25 μL，二氯甲烷(相对密度 1.32)2 μL，分别置100 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得相当于甲醇，乙醇，二氯甲烷质量浓度分别为 0.08，0.2，0.025 g/L 的混合限量对照溶液

系列对照品溶液:精密量取 20 μL 甲醇、50 μL 乙醇、4 μL 二氯甲烷，置100 mL容量瓶内，加注射用水至刻度，作为对照液Ⅰ;取对照液Ⅰ稀释1倍作为对照液Ⅱ;取对照液Ⅰ稀释10倍作为对照液Ⅲ;取对照液Ⅰ稀释20倍作为对照液Ⅳ，取对照液Ⅰ稀释40倍作为对照液Ⅴ。以上系列对照溶液中各有机溶剂的质量浓度分别为甲醇 0.004，0.008，0.016，0.08，0.16 g/L，乙醇 0.01，0.02，0.04，0.2，0.4 g/L 和二氯甲烷 0.001 25，0.002 5，0.005，0.025，0.05 g/L。

供试品溶液:取样品0.2 g，精密称定，置20 mL顶空瓶中，加水5.0 mL溶解，即得。

2.3 方法学考察

定位与系统适用性试验:取定位溶液分别进样测定，获得各有机溶剂的保留时间;然后取限量对照溶液进行系统适用性试验，计算各成分峰的柱效、分离度，重复进样响应值的RSD值，结果见表1。各组分色谱峰的理论板数均大于150 000，分离度大于1.5。同法测定空白溶剂色谱图和样品色谱图，结果见图1，可见空白溶剂对3种残留溶剂的测定无干扰。

表1 残留溶剂的系统适用性试验结果(n=6)

图1 气相色谱图

线性关系考察:精密吸取系列对照液5 mL，置顶空瓶中，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图。以峰面积(A)为纵坐标、质量浓度(C，μg/mL)为横坐标进行线性回归。结果见表2。

表2 各组分回归方程与线性范围(n=5)

最低检测限确定:将对照品溶液逐级稀释，测定。当信噪比为3 时，甲醇、乙醇、二氯甲烷的最低检测限分别为 4，1.6，1.2 μg/mL，相当于被检样品的0.01%，0.004%和0.003%。

精密度试验:精密量取对照品溶液5 mL，共6份，分别置顶空瓶中，按上述色谱条件进样测定。结果甲醇、乙醇、二氯甲烷的日内精密度RSD分别为 4.14% ，4.08% ，3.12%(n=6)，日间精密度分别为 4.21%，3.89%，4.49%(n=6)。

加样回收试验:以限量对照溶液为100%，取限量溶液浓度的80%，100%，120%3个浓度水平作为标准溶液。取同一批的依诺肝素钠0.2 g，精密称定，分别置9个20 mL顶空进样瓶中，分别精密加入低、中、高3个浓度水平的标准溶液5 mL，平行配制3份，作为回收率测定用溶液。按上述色谱条件进行测定，以外标法计算回收率。结果见表3。