高效液相色谱法测定灵芝提取物中尿苷和腺苷含量

卢端萍 ，蒋婷婷 ，陈 硕，王 勇

(1.福建省药品检验所，福建 福州 350001; 2.福建省立医院，福建 福州 350001)

灵芝为多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Karst.或紫芝Ganoderma sinenseZhao，Xu et Zhang 的干燥子实体[1]，具有补气安神、止咳平喘等功效。灵芝中主要含有多糖[2]、三萜[3－4]、核苷[5]、生物碱[6]、黄酮[4]、氨基酸及微量元素等多种化学成分，具有护肝、抗炎、抗高血压、抗肿瘤、调血脂、免疫调节等功能[7]。灵芝提取物作为灵芝类产品的主要原料之一，很有必要对其质量进行控制。笔者建立了可同时测定灵芝提取物(赤芝提取物和紫芝提取物)中尿苷和腺苷含量的反相高效液相色谱(RP－HPLC)法，并测定了不同产地的灵芝提取物中尿苷和腺苷的含量，为灵芝提取物的质量评价提供参考。

1 仪器与试药

Waters Acquity UPLC超高效液相色谱仪，包括二元泵、二极管阵列检测器、自动进样器，Empower色谱工作站;超声波清洗器(昆山仪器有限公司);超纯水器(赛多利斯)。灵芝提取物(将从全国不同产地收集的赤芝和紫芝子实体，由福建仙芝楼生物科技有限公司采用相同的提取工艺，即水提、浓缩、干燥制得);尿苷对照品(批号为 887－200001)、腺苷对照品(批号为 110879－200202)，均购自中国药品生物制品检定所;乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Agilent ZORBAX SB－Aq柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈(A)－水(B)，按表1进行梯度洗脱;流速:0.8 mL/min;检测波长:260 nm。柱温:室温;进样量:5 μL。理论板数按尿苷算应不低于5 000。在此色谱条件下，尿苷和腺苷与其他组分分离较好，色谱图见图1。

表1 流动相梯度洗脱程序

图1 高效液相色谱图

2.2 溶液制备

取尿苷、腺苷对照品适量，精密称定，加10%甲醇制成每1 mL含尿苷 100 μg/mL、腺苷 10 μg/mL的混合溶液，即得对照品溶液。取本品0.2 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入10%甲醇25 mL，称重，超声处理5 min，补足减失质量，滤过，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察:精密称取尿苷、腺苷对照品适量，加10%甲醇分别制成含尿苷 195.6 μg/mL、腺苷 105.6 μg/mL 混合对照品溶液，精密吸取 0.25，0.50，1.00，2.00，5.00，10.00 mL，置10 mL容量瓶中，加10%甲醇稀释至刻度。以峰面积(mAU)为纵坐标、对照品质量浓度(μg/mL)为横坐标绘制标准曲线，得回归方程，尿苷为Y=15.426X－ 2.331 8(r=1.000 0)，腺苷为Y=21.252X－3.457 9(r=1.000 0)。结果表明，尿苷和腺苷质量浓度分别在 4.89 ～195.6 μg/mL 和 2.64 ～105.6 μg/mL 范围内与峰面积呈良好的线性关系。

精密度试验:取同一对照品溶液，按拟订的色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果尿苷和腺苷色谱峰峰面积的RSD分别为1.7%和1.9%(n=6)，表明仪器精密度良好。

重复性试验:取同一赤芝提取物(1号)样品6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，按拟订的色谱条件进样测定。结果尿苷和腺苷含量分别为 12.09 mg/g和 1.04 mg/g，RSD分别为1.66%和1.89%(n=6)，表明方法具有良好的重复性。

稳定性试验:取同一供试品溶液，分别于 0，2，4，8，12，18，24 h时进样，按拟订的色谱条件测定。结果尿苷、腺苷含量的RSD分别为0.28%和1.44%(n=7)，表明供试品溶液在24 h内稳定。

加样回收试验:取已知含量的赤芝提取物(1号)样品0.1 g，精密加入与样品中含有量相当的尿苷和腺苷对照品，按供试品溶液制备方法制备待测溶液，按拟订的色谱条件测定，计算回收率。结果见表2。

耐用性试验:考察了不同色谱柱和流动相对赤芝提取物(1号)中尿苷和腺苷的含量测定结果。结果见表3，表明该方法耐用性良好。

2.4 样品含量测定

分别对10批赤芝提取物和8批紫芝提取物样品进行含量测定。结果见表4。

表2 加样回收试验结果(n=6)

表3 耐用性试验结果

表4 赤芝和紫芝提取物样品含量测定结果(mg/g)

3 讨论

由表4可见，不同产地的赤芝和紫芝提取物中尿苷、腺苷含量及二者总量差异较大，同一产地、不同批次的紫芝或赤芝提取物中尿苷、腺苷含量及二者总量也存在一定差异。不同产地的灵芝提取物中尿苷和腺苷含量差异较大，可能系灵芝不同生长环境、不同培养基质及不同采收季节等因素影响所致。

曾采用磷酸盐缓冲液(pH=6.5)－甲醇[1](17∶3)为流动相，后考察不同比例的甲醇－水[8]及乙腈－水[9－10]为流动相，结果用缓冲盐和水的分离效果无明显差异，且用乙腈－水时尿苷和腺苷出峰较快且峰形较好。曾以对水、10%甲醇、20%甲醇作为提取溶剂，考察结果表明，不同提取溶剂提取的尿苷、腺苷含量无显著性差异，选择10%甲醇较合适。还对不同的提取时间(5，10，15，20 min)进行考察，结果超声提取5 min时样品中尿苷、腺苷已提取完全。

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