灯盏花素分散片质量标准研究＊

黄晓燕，丁 野，郑金凤，李文莉

(湖南省食品药品检验研究院，湖南 长沙 410001)

灯盏花素是从菊科植物短亭飞蓬Erigeron breviscapus(Vant.)Hand.－Mazz.中以野黄芩苷为主的提取物。灯盏花素分散片是由灯盏花素原料制成的中药固体制剂，具有活血化瘀，通络止痛的功效，临床用于中风后遗症、冠状动脉粥样硬化性心脏病、心绞痛[1－2]。灯盏花素分散片中可能含有的肝毒性成分焦袂康酸[3]，会对长期服用的患者肝脏有较大损伤，因此建立焦袂康酸的限量检查方法对于保证本品临床用药的安全性具有重要意义。为更好地控制灯盏花素分散片的质量，笔者采用薄层色谱法建立了野黄芩苷的薄层色谱鉴别法，并采用高效液相色谱法对野黄芩苷进行了含量测定。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪(包括自动进样器，柱温箱，Chemstation工作站，Agilent公司);瑞士CAMAG Reprostar3型薄层摄像系统;AE240型电子天平(德国梅特勒公司);CG－300型超声清洗仪(功率300 W，频率25 kHz，张家港市港威超声电子有限公司);聚酰胺薄膜(浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂)。野黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号为110842－200605);焦袂康酸对照品(天津市奎青商贸有限公司，批号为20100522，纯度为98%);水为重蒸水，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。灯盏花素分散片(批号 090701，090702，090703，090704，090801，100301，100401，购自国内某制药公司)。

2 方法与结果

2.1 野黄芩苷薄层色谱鉴别

取本品2片，研细，加甲醇25 mL，超声处理30 min，滤过，滤液作为供试品溶液。另取野黄芩苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。按处方比例称取辅料适量，同法制备阴性对照品溶液。照薄层色谱法[2010年版《中国药典(一部)》附录ⅥB]试验，吸取上述3种溶液各1 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以冰醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铁乙醇溶液。供试品溶液色谱中，在与野黄芩苷对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液对测定无干扰(见图1)。

图1 野黄芩苷薄层色谱图

2.2 焦袂康酸限量检查

2.2.1 色谱条件

色谱柱:Agilent TC C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:A为甲醇，B为0.1%磷酸水溶液，洗脱梯度(0～25 min，100%B;25～27 min，0%→30%A;27～35 min，30%A);流速:0.8 mL/min;柱温:35 ℃;检测波长:270 nm;进样体积:5 μL。

2.2.2 溶液制备

取本品粉末0.9 g，精密称定，置25 mL容量瓶中，加入甲醇20 mL，超声处理(功率300 W，频率25 kHz)30 min，冷却至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按灯盏花素分散片处方比例及工艺制成成不含灯盏花素的阴性样品，依法制备阴性对照品溶液。精密称取焦袂康酸对照品10.60 mg，置10 mL容量瓶中，加适量甲醇使溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。将此对照品溶液进一步稀释得质量浓度为84.8 μg/mL 的对照品溶液Ⅰ，质量浓度为 10.176 μg/mL 的对照品溶液Ⅱ以及质量浓度为1.017 6 μg/mL的对照品溶液Ⅲ。

2.2.3 方法学考察

专属性试验:取焦袂康酸对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液，在上述色谱条件进样，色谱图见图2。可见，焦袂康酸峰形良好，且阴性对照溶液色谱中，在焦袂康酸对照品相应的保留时间附近无干扰峰。

图2 焦袂康酸高效液相色谱图

线性关系考察:精密吸取 2.2.2 项下对照品溶液Ⅰ5，10 μL、对照品溶液Ⅱ1，2，5，10 μL注入液相色谱仪，以峰面积为纵坐标(Y)、进样量(μg)为横坐标(X)绘制标准曲线，回归方程为Y=10 000 000X－145 577，r=0.999 0(n=6)。结果表明，焦袂康酸对照品进样量在0.010 2～0.848 μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验:精密吸取同一对照品溶液，依法重复进样6次。结果的RSD为1.20%(n=6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:精密吸取同一供试溶液，分别于配制后的0，4，8，12，16，24 h 时依法测定。结果的RSD为 1.09%(n=6)，表明供试品溶液在配制后24 h内基本稳定。

重复性试验:取同一批(批号为090701)样品，分别按2.2.2项下方法制备5份供试品溶液，依法测定。结果均未检出焦袂康酸。

检测限和定量限确定:以信噪比约为3∶1确定，检测限为2.0 ng。以信噪比约为10∶1时连续进样5次，峰面积的RSD为3.57%，定量限为 5.0 ng。

加样回收试验:取已测定含量的同一批(批号为090701，未检出焦袂康酸)样品内容物6份，每份约0.45 g，精密称定，分别精密加入对照品适量，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，依法测定并计算回收率。结果见表1。

表1 焦袂康酸加样回收试验结果(n=6)

2.2.4 样品检测

取不同批号的7批样品，依法测定，结果所有批号的样品均未检出焦袂康酸。

2.3 野黄芩苷含量测定

2.3.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Agilent TC C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇－四氢呋喃－0.1%磷酸溶液(14∶14∶72);流速:0.8 mL/min;检测波长:335 nm;柱温:35℃;进样体积:10 μL。理论塔板数按野黄芩苷峰计算，应不低于3 000。此条件下野黄芩苷峰峰形对称、尖锐，与相邻峰达到基线分离。色谱图见图3。

图3 野黄芩苷高效液相色谱图

2.3.2 溶液制备

取质量差异项下的本品，研细，取约0.08 g，精密称定，置100mL容量瓶中，加入甲醇适量，超声处理(功率300W，频率25kHz)15 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按灯盏花素分散片处方比例及工艺制成成不含灯盏花素的阴性样品，依法制备阴性对照品溶液。精密称取野黄芩苷对照品10.60 mg，置50 mL量瓶中，加入甲醇适量，振摇使溶解，加甲醇稀释至刻度，即得对照品溶液。将此对照品溶液进一步稀释得浓度为53 μg/mL的对照品溶液Ⅰ。

2.3.3 方法学考察

专属性试验:取野黄芩苷对照品、供试品溶液和阴性对照溶液，在上述色谱条件进样。结果阴性对照品溶液色谱中，在野黄芩苷对照品相应的保留时间附近无干扰峰(图3)。

线性关系考察:精密吸取对照品溶液(0.212 g/L)10 μL及对照品溶液Ⅰ(0.053g/L)1，2，5，10，15μL，注入液相色谱仪，以峰面积为纵坐标(Y)、进样量(μg)为横坐标(X)绘制标准曲线，回归方程为Y=3 965.3X+7.790 9，r=0.999 8(n=6)。结果表明，野黄芩苷对照品进样量在0.053～2.12μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验:精密吸取同一对照品溶液，依法重复进样6次。结果的RSD为0.12%(n=6)，表明精密度良好。

稳定性试验:精密吸取同一供试品溶液(批号为090701)，分别于配制后的 0，4，8，12，16，24 h 时依法测定。结果的RSD为0.26%(n=6)，表明供试品溶液在配制后24 h内基本稳定。

重复性试验:取同一批(批号为090701)样品，分别按2.3.2项下方法制备5份供试品溶液，依法测定。结果样品中野黄芩苷的平均含量为每片 16.73 mg，RSD为 1.59%(n=5)。

检测限和定量限确定:以信噪比约为3∶1确定，检测限为5.3 ng。以信噪比约为 10:1时连续进样5次，峰面积RSD为1.46% ，定量限为 15.9 ng。

加样回收试验:取已测定含量的同一批(批号为090701)样品内容物6份，每份约0.04 g，精密称定，分别精密加入对照品适量，按2.3.2项下方法制备供试品溶液，依法测定并计算野黄芩苷的回收率。结果见表2。

表2 野黄芩苷加样回收试验结果(n=6)

2.3.4 样品含量测定

取不同批号的7批样品，依法测定。结果批号分别为090701，090702，090703，090704，090801，100301，100401 的样品中 每 片 分 别 含 野 黄 芩 苷 16.99，16.54，16.09，16.36，15.54，15.67，16.86 mg。

3 讨论

采用薄层色谱法对灯盏花素分散片中的野黄芩苷进行了鉴别，结果薄层色谱斑点清晰、方法专属性强、重现性好，且阴性无干扰。在12，20，28℃ 3种温度和35%，57%，78%3种相对湿度条件下进行温度及湿度影响因素考察，结果显示温度和相对湿度的变化对薄层色谱鉴别无明显影响。

焦袂康酸的检测方法文献报道较少，2010年版《中国药典(一部)》中仅有“灯盏生脉胶囊”一个品种的焦袂康酸检查方法。参照该化学反应法试验，发现该反应专属性不强，故考虑采用高效液相色谱法进行限量检查。结果表明，采用高效液相色谱法进行限度检查准确、灵敏度高，提高了检测的可信度。

野黄芩苷含量测定时，曾考察了甲醇－0.1%磷酸系统、甲醇－0.1mol/L 醋酸铵溶液系统、甲醇 － 四氢呋喃 －0.1%磷酸系统[1，4－6]。结果甲醇－四氢呋喃－0.1%磷酸系统所得野黄芩苷色谱峰的对称性相对而言最理想，故选择甲醇－四氢呋喃－0.1%磷酸系统为流动相。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:378，707.

[2]WS3－B－2516－97.中华人民共和国卫生部药品标准(第十三册)[S].

[3]Kazuyuki Kitamura，Hitoshi O Iwasaki，Akira Yasoshima.Pathology of Chemically Induced Chronic Active Hepatitis In Mice[J].Experimental And Molecular Pathology，1992，57(2):153 －166.

[4]Bhathal PS，Ho SL，Hegarty MP，et al.Chronic active hepatitis in mice inducedby3 －hydroxy －4 － pyrone[J].Experientia，1984，40(8):894 －896.

[5]郑金凤，李文莉，冯 芳，等.HPLC法测定灯盏花素注射液中野黄芩苷含量及有关物质[J].药物分析杂志，2011，31(1):34－38.

[6]严亚锋，马文龙.HPLC法测定心脑联通分散片中野黄芩苷的含量[J].陕西中医学院学报，2011，34(4):88－89.