腰舒胶囊质量标准研究＊

2013-09-14郭剑华刘渝松马善治彭文忠廖兴隆

中国药业 2013年20期

郭亮，郭剑华，刘渝松，马善治，林於，刘新，彭文忠，王健，廖兴隆，胡晓

(1.重庆市中医骨科医院，重庆 400010;2.重庆医科大学，重庆 400016)

腰舒胶囊由丹参、党参、当归、川牛膝、狗脊、槲寄生、制川乌、全蝎、熟地黄9味药材组方，为中药复方医院制剂，具补肝肾、益气血、祛风湿、通经络之功效，临床用于腰椎间盘突出症祛风通络、舒筋活血，疗效显著。采用薄层色谱(TLC)法对制剂中的川牛膝、当归、狗脊、党参、槲寄生、丹参进行定性鉴别，采用高效液相色谱(HPLC)法测定制剂中有效成分丹参酮ⅡA的含量，旨在为该制剂的质量控制和评价奠定基础。现报道如下。

1 仪器与试药

SY－810型高效液相色谱仪(瑞利分析仪器公司);AG135型1/10万天平(Mettler Toledo公司)。腰舒胶囊及各阴性样品(重庆市中医骨科医院制备);川牛膝对照药材(批号为121066－200203)、当归对照药材(批号为120927－200512)、狗脊对照药材(批号为121071－200502)、党参对照药材(批号为121057－200303)、槲寄生对照药材(批号为121075－200402)、丹参酮ⅡA对照品(批号为20041207)，均由中国药品生物制品检定所提供;乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

川牛膝:取胶囊内容物20 g，加乙醇100 mL，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水50 mL使溶解，用乙酸乙酯30 mL萃取，弃去乙酸乙酯液，水液继续用水饱和的正丁醇30 mL萃取，分取正丁醇液，蒸干，残渣加乙醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。取不含川牛膝的阴性样品，同法制备阴性对照品溶液。取川牛膝对照药材2 g，加乙醇50 mL，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2 mL使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、阴性对照品溶液、对照药材溶液各5～10 μL，分别点于同一以0.3%羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)－乙酸乙酯－甲醇－浓氨(12∶6∶3∶0.5)为展开剂，浓氨水预平衡20 min，展开至12～14 cm，取出，晾干，喷以香草醛硫酸试液，在105℃加热至斑点清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，置紫外光灯(365 nm)下检视显相同颜色的荧光斑点，阴性对照品溶液色谱则无此斑点(图A1－A2)。

当归:取胶囊内容物20 g，加乙醇100 mL，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水50 mL使分散，用石油醚(60～90℃)50 mL萃取，分取石油醚液，蒸干，残渣加乙醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。取不含当归的阴性样品，同法制备阴性对照品溶液。取当归对照药材2 g，加乙醇50 mL，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2 mL使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性对照品溶液各10～15 μL、对照药材溶液5～10 μL，分别点于同一以0.3%羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以环己烷－乙酸乙酯(10∶1)为展开剂，展开至10～12 cm，取出，晾干，再喷以香草醛硫酸试液，在105℃加热至斑点清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，置紫外光灯(365 nm)下检视显相同颜色的荧光斑点，阴性对照品溶液色谱则无此斑点(图B1－B2)。

狗脊[1]:取胶囊内容物20 g，加乙醇100 mL，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水50 mL使分散，用石油醚30 mL萃取，弃去石油醚液，分取水液，加乙酸乙酯50 mL萃取，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。取不含狗脊的阴性样品，同法制备阴性对照品溶液。取狗脊对照药材2 g，加乙醇50 mL，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2 mL使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法[1]试验，吸取供试品溶液、阴性对照品溶液、对照药材溶液各10～15 μL，分别点于同一以0.3%羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以环己烷－乙酸乙酯(20∶2)为展开剂，展开至10～12 cm，取出，晾干，喷以香草醛硫酸试液，在105℃加热至斑点清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，置紫外光灯(365 nm)下检视显相同颜色的荧光斑点，阴性对照品溶液色谱则无此斑点(图C1－C2)。

党参:取胶囊内容物6 g，加正丁醇40 mL，超声处理30 min，滤过，滤液水浴浓缩至约1 mL，作为供试品溶液。取不含党参的阴性样品，同法制成阴性对照品溶液。另取党参对照药材2 g，加正丁醇20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液水浴浓缩至1 mL，作为对照药材溶液。照薄层色谱法[1]试验，吸取供试品溶液及阴性对照品溶液 10～20 μL、对照药材溶液 10～15 μL，分别点于同一以0.3%羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正丁醇－乙醇－水(15∶3∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液色谱则无此斑点(图D)。

槲寄生:取胶囊内容物5 g，加乙醇50 mL，加热回流1 h，滤过，取滤液，加盐酸3 mL，加热回流1 h后浓缩至约10 mL，加水20 mL，用石油醚(60～90℃)萃取3次，每次20 mL，石油醚萃取液蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取不含槲寄生的阴性样品，同法制备阴性对照品溶液。取槲寄生对照药材1.5 g，加乙醇30 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法[1]试验，吸取供试品溶液及阴性对照品溶液各10 μL、对照药材溶液5 μL，分别点于同一以0.3%羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿－甲醇(40∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%磷钼酸乙醇溶液，在110℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液色谱则无此斑点(图E)。

丹参[2]:取胶囊内容物6 g，加乙醇30 mL，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL使分散，用乙醚30 mL萃取，分取乙醚层，低温蒸干，残渣加乙醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。取不含丹参的阴性样品，同法制备阴性对照品溶液。取丹参酮ⅡA对照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含2 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法[1]试验，吸取供试品溶液及阴性对照品溶液各10 ～15 μL、对照品溶液 10 μL，分别点于同一以 0.3%羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以苯－乙酸乙酯(19∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液则无此斑点(图F)。

图1 薄层色谱鉴别图

2.2 丹参酮ⅡA含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Amethyst C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇－水(9 ∶1);流速:1 mL/min;检测波长:270 nm;进样量:20 μL。该色谱条件下，理论板数按丹参酮ⅡA峰计算应不低于8 000，葛根素峰分离良好，阴性无干扰(见图2)。

图2 高效液相色谱图

2.2.2 溶液制备

取胶囊内容物7 g，碾细，精密称定，用乙醇50 mL回流提取30 min，滤过，残渣再用50 mL乙醇超声处理5 min，滤过，合并滤液，置蒸发皿中蒸干，残渣加水30 mL使分散，转入分液漏斗中，蒸发皿用30 mL乙醚反复洗涤，洗涤液并入分液漏斗中，再用60 mL乙醚分两次萃取，合并乙醚萃取液，蒸干，残渣用甲醇分次使溶解并转移至25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。精密称取丹参酮ⅡA对照品适量，用甲醇制成每1 mL含4 μg的溶液，即得对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

线性关系考察:精密称取丹参酮ⅡA对照品适量，用甲醇制成每 1 mL 含 1.0，3.0，4.0，5.0，10.0 μg/mL 的系列对照品溶液，在选订的色谱条件下分别进样20 μL，记录色谱图。以丹参酮ⅡA吸收峰面积积分值为纵坐标 Y、进样质量浓度 X为横坐标绘制标准曲线，线性回归方程为 Y=127 210.6 X，r=0.999 6结果表明，丹参酮ⅡA质量浓度在 1.0 ～10.0 μg/mL 范围内与其峰面积积分值线性关系良好。

精密度试验:吸取同一丹参酮ⅡA对照品溶液，重复进样5次，记录丹参酮ⅡA的峰面积积分值。结果的 RSD为 0.27%(n=5)，表明仪器的精密度良好。

稳定性试验:取同一刚制备的供试品溶液，分别于0，4，8，12，24 h在选订的色谱条件下进样20 μL，记录丹参酮ⅡA的峰面积积分值。结果的 RSD为1.3%(n=5)，表明供试品溶液在24 h内保持稳定。

重复性试验:取同一批样品，精密称定，依法制备5份供试品溶液，在选订的色谱条件下分别进样20 μL，记录丹参酮ⅡA的峰面积积分值。结果的 RSD为1.0%(n=5)，表明方法重现性良好。

加样回收试验:取已知丹参酮ⅡA含量的样品6份，精密称定，分别精密加入丹参酮ⅡA对照品的甲醇稀释液，依法制备6份供试品溶液并测定，记录丹参酮ⅡA的峰面积积分值。结果平均回收率为92.8%。