透骨草提取物对人肝癌SMMC－7721细胞p53和PUMA蛋白表达的影响＊

姜春雨，曾常茜

(1.吉林省图们市石岘镇中心卫生院药剂科，吉林 延边 133101; 2.大连大学医学院·辽宁省生物有机重点实验室，辽宁 大连 116622)

对于大多数肝癌患者，化学治疗仍为主要的治疗手段。然而目前临床应用的抗肝癌药物在杀伤肝癌细胞的同时，对某些正常的细胞也有一定程度的损害[1－2]。因此，寻找对肝癌疗效好且毒副作用小的药物成为目前的重要课题。透骨草 Phryma leptostachya L.var.asiatica Hara为透骨草科植物的干燥全草入药，具有清热解表、活血消肿作用[3]。本研究中观察了透骨草提取物对人肝癌SMMC－7721细胞形态的影响，并通过检测透骨草提取物对SMMC－7721细胞p53和p53上调凋亡调控因子(PUMA)蛋白表达的影响，进一步探讨透骨草提取物诱导SMMC－7721细胞凋亡的分子机制，旨在为透骨草抗肝癌作用的研究提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

人肝癌SMMC－7721细胞，由吉林省肿瘤研究所提供;鼠抗人p53抗体和鼠抗人PUMA抗体(编号为4976)购自Cell Signaling Technology公司，通用型SP试剂盒(批号为812251A)、DAB显色试剂盒(批号为K107715A)购自福州迈新生物技术公司。RPMI 1640(批号为307964)、小牛血清和胰蛋白酶为美国Gibco公司产品;MTT和DMSO为Sigma公司产品;药物采自辽宁金州大黑山，经王心毓先生鉴定为透骨草科植物。BB16UV型CO2培养箱，德国Heraeus公司;CKX41型倒置显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 方法

透骨草提取物制备方法:采取加热回流提取法。取干燥透骨草50 g，加8倍量75%乙醇，提取2 h，过滤，滤液水浴浓缩成干膏。

细胞培养:SMMC－7721细胞使用RPMI 1640培养基培养，应用时加入青霉素100 U/mL、链霉素100 mg/L和含10%灭活的小牛血清，置37℃及5%CO2培养箱中培养。

倒置显微镜观察检测SMMC－7721细胞形态:选取处于对数生长期且生长良好的SMMC－7721细胞，将其接种于6孔细胞培养板中，每孔2.0 mL，37℃ 5%CO2孵育12 h。弃去孔中培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次。试验组加入终质量浓度为40.91 μg/mL 的透骨草提取物(IC50)2.0 mL，对照组加入等体积的RPMI－1640细胞培养液，继续孵育24 h，观察倒置显微镜下活细胞形态变化情况。

免疫组化方法检测SMMC－7721细胞p53和PUMA蛋白的表达:按试剂盒说明进行操作。将对数生长期的SMMC－7721细胞以1.0×105个/mL细胞加入培养瓶，37℃ 5%CO2培养24 h，待细胞贴壁后，加入终浓度为40.91 μg/mL的透骨草提取物，另设RPMI 1640培养液作为对照。继续培养96 h，弃去培养液，PBS洗涤2次，消化并收集细胞，用PBS稀释SMMC－7721细胞为1.0×106个 /mL。SMMC －7721细胞涂片，丙酮固定 20 s，PBS冲洗2 min×3次，滴加内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育15 min，PBS冲洗3 min;滴加正常非免疫动物血清，室温孵育15 min，弃血清，分别滴加鼠抗人鼠抗人p53抗体、鼠抗人PUMA抗体，37℃孵育2 h，PBS冲洗2 min×3次。滴加生物素标记二抗，室温孵育15 min，PBS冲洗2 min×3次，滴加链霉菌抗生物素－过氧化物酶溶液，室温孵育10 min，PBS冲洗2 min×3次。加DAB底物混合液，镜下观察显色，自来水终止显色。苏木素复染，封片，置显微镜下观察。在显微镜下随机计数200个细胞，细胞核或细胞浆出现棕色判断为阳性细胞，无棕色染色者为阴性细胞，计算阳性细胞占所有细胞的比例。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 对SMMC－7721细胞形态的影响

倒置显微镜下观察可见，对照组SMMC－7721细胞贴壁生长，密集排列、形态呈梭形或多边形，胞体透亮折光性好。40.91 μg/mL透骨草提取物作用于 SMMC－7721细胞24 h后，细胞胞体积明显缩小，形态不规则，轮廓不清晰，细胞皱缩变形，细胞脱壁增加。

2.2 对SMMC－7721细胞p53和PUMA蛋白表达的影响

免疫组化方法观察结果显示，未用透骨草提取物处理的对照组SMMC－7721细胞p53蛋白低表达，细胞核着棕黄色的细胞量少，经40.91 μg/mL透骨草提取物处理后的 SMMC－7721细胞p53蛋白表达明显增高，细胞核着棕黄色的细胞量多，经统计学处理差异显著(P＜0.01);未用透骨草提取物处理的对照组SMMC－7721细胞PUMA蛋白低表达，细胞浆着棕黄色的细胞量少，经40.91 μg/mL透骨草提取物处理后的 SMMC－7721细胞PUMA蛋白表达明显增高，细胞浆着棕黄色的细胞量多，经统计学处理差异显著(P＜0.01)。见表1。

表1 免疫组化法检测SMMC－7721细胞p53和PUMA蛋白表达结果(±s，n=3)

表1 免疫组化法检测SMMC－7721细胞p53和PUMA蛋白表达结果(±s，n=3)

注:与对照组比较，△P ＜0.01。

组别对照组试验组p53(%)14.4±1.2 7.8±1.8△PUMA(%)15.5±1.6 52.6 ±1.9△

3 讨论

笔者的前期研究发现，透骨草提取物对人卵巢癌SKOV3细胞、人乳腺癌 MCF－7细胞、人宫颈癌胞 Hela细胞、人肝癌HepG－2细胞、人肺癌A549细胞增殖有显著的抑制作用[4]。本研究中用倒置显微镜下观察发现，40.91 μg/mL 透 骨草提取物作用后的SMMC－7721细胞与对照组相比，细胞胞体积明显缩小，形态不规则，细胞皱缩变形，细胞脱壁增加，从形态学上证明透骨草提取物可诱导SMMC－7721细胞凋亡。

p53基因是重要的肿瘤抑制基因，能影响多种细胞内信号转导通路，抑制细胞增殖活化、诱导细胞凋亡、抑制某些信号转导以及抑制血管新生等[5]。本研究中通过免疫组化方法检测发现40.91 μg/mL透骨草提取物处理的SMMC－7721细胞24 h后，p53蛋白表达显著增加，表明透骨草提取物可能通过上调p53蛋白表达诱导SMMC－7721细胞凋亡。

p53基因的抗肿瘤作用有赖于其激活下游靶基因，并诱导细胞凋亡或细胞周期阻滞。PUMA是Bcl－2蛋白家族中促凋亡成员之一，因其含有一个BH3结构域，亦称为BH3仅有蛋白，是细胞凋亡的重要启动子。研究发现，PUMA是p53诱导细胞凋亡或细胞周期阻滞的靶基因[6－7]，p53的结合位点位于PUMA的上游启动序列中，感应到凋亡刺激信号后，p53会结合其位于上游启动序列中的结合位点，从而诱发PUMA转录及其蛋白表达[8]。为了进一步探究透骨草提取诱导SMMC－7721细胞凋亡是否与p53下游因子PUMA的表达相关，本研究中通过免疫组化方法检测发现，40.91 μg/mL透骨草提取物处理的 SMMC－7721细胞24 h后，PUMA蛋白表达显著增加，表明透骨草提取物可能通过上调PUMA蛋白表达诱导SMMC－7721细胞凋亡。鉴于PUMA对p53的依赖性，推测透骨草提取物诱导SMMC－7721细胞凋亡的机制可能与上调p53，进而上调PUMA蛋白表达有关。P53/PUMA通路诱导细胞凋亡是由多个信号转导蛋白参与的复杂过程，相关分子机制有待进一步更深入的研究。

[1]Trotti A，Colevas AD，Setser A，et al.CTCAE v3.0:development of a comprehensive grading system for the adverse effects of cancer treatment[J].Semin Radiat Oncol，2003，13(3):176 － 181.

[2]Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics，CA:a cancer[J].J Clin，2008，58(2):71 － 96.

[3]高 松.辽南地区药用植物图鉴[M].北京:科学出版社，2008:196.

[4]曾常茜，高 松，沈 阳，等.透骨草提取物对肿瘤细胞体外增殖的影响[J].辽宁中医杂志，2009，36(11):1 952－1 954.

[5]Wang JL，Jiao SC，Hu Y，et al.Effect of Recombinant Human Adenovirus p53 Combined with Cisplatin on the Expression of Human Lung Adenocarcinoma A549 Cell Gene[J].Acta Acad Med Sin，2010，32(4):383 － 388.

[6]Liu XH，Zhang XF，Wang YL.Inhibitive effect of 3 －bromopyruvic acid on human breast cancer MCF－7 cells involves cell cycle arrest and apoptotic induction[J].Chinese Medical Journal，2009，122(14):1 681 － 1 685.

[7]Peng QP，Liang HJ，Zhou Q，et al.Expression of hexokinase－ Ⅱgene in human colon cancer cells and the therapeutic significance of inhibition thereof[J].Zhonghua Yixue Zazhi，2007，87(15):1 058 －1 062.

[8]Yu J，Yue W，Wu B，et al.PUMA Sensitizes Lung Cancer Cells to Chemotherapeutic Agents and Irradiation[J].Clin Cancer Res，2006，12(9):2 928 －2 936.