犀角地黄汤对胶原诱导性关节炎大鼠模型滑膜组织中磷脂酶C-γ1表达的影响

李 茜 高 峰 杨学文

1.南京中医药大学针药结合重点实验室，江苏南京 210046；2.南京中医药大学附属医院检验科，江苏南京 210029

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）急性期发病迅速，病程持续，关节僵硬肿痛，甚至生活不能自理，给患者造成极大的痛苦。目前临床治疗方案多以大量使用激素及免疫抑制剂为主，这种方案主要有两大问题：一是具有不可忽视的副作用；二是对一些不适宜使用激素或免疫抑制剂的患者无从下手。因而近年来中医药治疗RA的作用越来越引起关注，从瘀热的病理角度治疗类风湿关节炎得到普遍认同[1]。本研究测定大鼠关节滑膜组织中磷脂酶C-γ1（PLC-γ1）在大鼠胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型形成以及应用犀角地黄汤治疗过程中的表达水平，目的在于进一步探讨犀角地黄汤治疗RA急性期的作用机制。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

6～8 周龄雄性 SD 大鼠 45 只，体重（150±10）g，购于上海斯莱克实验动物中心。

1.2 药品与试剂

犀角地黄汤（犀角、生地黄、芍药、丹皮、虎杖、地龙）由南京中医药大学附属医院药剂科配制。鸡Ⅱ型胶原蛋白、完全福氏佐剂购自美国Sigma公司；Trizol购自Invitrogen公司；反转录试剂盒、DNA marker、Taq DNA聚合酶试剂盒购自大连TaKaRa公司；引物、探针委托Invitrogen公司合成：根据文献[2]合成PLC-γ1（Forwards：5'-GTCGACCTCATCAGCTACTA-3'；Reverses：5'-GGCTGTTCTCATCCAGATGC-3'） ，采用看家基因磷酸甘油脱氢酶（GAPDH）（Forwards：5'-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3'；Reverses：5'-AGATCCACAACGGATACATT-3）作为内对照。

1.3 仪器

Eppen-dorf Centrifuge 5417R高速冷冻离心机、Biophotome-ter紫外可见分光光度计为德国Eppendorf公司产品；ABI7500实时荧光PCR仪为美国ABI公司产品；凝胶成像系统为日本Kodak公司产品。

2 方法

2.1 大鼠分组及CIA模型构建

2.1.1 分组 将6～8周龄雄性SD大鼠45只， 于清洁环境中适应性饲养1周后，应用随机方法分为3组，即空白对照组，CIA模型组，犀角地黄汤实验组，每组15只。给各组大鼠称重，其周龄、体重差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。

2.1.2 CIA 模型构建 配置Ⅱ型胶原（CⅡ）乳剂：将 CⅡ溶于0.01 mol/L冰醋酸中，搅拌使其充分溶解，配置浓度为2 g/L并4℃过夜后，与同等体积的完全福氏佐剂在冰浴中充分搅拌混合，使其乳化制成CⅡ乳剂，最终配置浓度为1 g/L。将CⅡ乳剂以0.007 mL/g的剂量在模型组、实验组大鼠的背部、尾根及足底部进行多点皮内注射，1周后重复注射1次加强免疫。空白对照组：将生理盐水按照与CⅡ乳剂的相同剂量及部位对大鼠进行多点皮内注射。1周后同样注射1次[3]。

2.2 动物模型的给药

实验组灌胃给予犀角地黄汤，根据体表面积公式换算大鼠与人的等效剂量后（200 g大鼠的给药剂量=70 kg 人的给药剂量×0.018），按 0.025 g/kg 体重给药。空白对照组及模型组均以蒸馏水0.5 mL/d灌胃，每日1次，治疗6周。

2.3 模型及治疗评价

观察各组大鼠的症状及治疗过程，使用容积法测量大鼠后肢的肿胀度：用带刻度的10 mL小试管装水，固定大鼠，以胫骨下端内躁处为解剖标志点标记，将待测后肢（包括整个足掌）深入液面下，使液面达标记处，观察并记录水面上升数值。致炎后每5天测量1次，记录容积，计算其关节肿胀度。肿胀度（%）=（Vt-V0）/V0×100%，其中，V0为造模前容积；Vt为造模后容积。结合病理切片评价模型建立是否成功以及药物疗效。

2.4 标本制备

在模型给药后第42天将各组动物统一处死，取大鼠足踝关节滑膜组织，用无菌生理盐水清洗后快速放入1%DEPC水处理过的冻存管中，入液氮保存。充分研碎冷冻组织后，置于加入1 mL Trizol的离心管中裂解，经过氯仿萃取、异丙醇沉淀、含7.5%DEPC乙醇洗涤过程后，将抽提出的RNA中加入30 μL DEPC水进行溶解，用紫外分光光度计检测RNA的浓度。计算RNA的浓度并取总RNA 2 μg进行逆转录，根据公式总 RNA（μg/mL）=A260×稀释倍数×40 μg/mL。 逆转录采用二步法：①在0.2 mL离心管中加入模板总RNA 2 μg，50 pmol/μL oligo（dT）1 μL，补 DEPC 水至管内液体总体积达12 μL；加热70℃ 5 min后冰上急冷5 min。②再加入400 U/μL RNAseinhibitor 200 U、10 mmol/L dNTP 1 μL、200 U/μL M-MLV 酶 1 μL、5×buffer 4 μL，补 DEPC 水至管内液体总体积达 20 μL。设定反应条件 42℃ 60 min、85℃ 5 min将RNA逆转录为cDNA，cDNA放置于-20℃保存。

2.5 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR检测大鼠PLC-γ1 mRNA参照文献[3]的反应条件，在ABI 7500实时荧光PCR仪上进行。读出PLC-γ1 mRNA与GAPDH拷贝数，将PLC-γ1 mRNA的拷贝数除以相应标本GAPDH的拷贝数，从而得到PLC-γ1 mRNA相对表达量。

2.6 统计学方法

采用SPSS 13.0软件对检测数据进行统计学处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 模型及治疗评价

大鼠足-踝关节肿胀度的测定结果：模型组足-踝关节肿胀度明显大于空白对照组（P＜0.01），实验组足-踝关节肿胀度小于模型组（P＜0.05）。见表1。病理切片显示：空白对照组关节腔滑膜组织未见炎性反应（图1）；模型组关节腔滑膜组织可见炎症细胞浸润，纤维组织填充（图2）；实验组关节腔滑膜组织增生，有轻度充血（图3）。结合以上实验结果证明：大鼠关节炎模型造模成功，并证实犀角地黄汤对大鼠关节肿胀有抑制作用。

表1 不同时期各组大鼠关节肿胀度的变化（%，±s）

表1 不同时期各组大鼠关节肿胀度的变化（%，±s）

注：与空白对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，△P<0.05

空白对照组模型组实验组15 15 15 0 31.73±1.81*29.76±1.56 0 28.31±1.43*24.77±1.29△0 27.66±1.27*21.75±1.16△0 27.14±1.36*18.74±0.12△组别 只数 10 d 20 d 30 d 40 d

图1 空白对照组（HE染色，400×）

图2 模型组（HE染色，400×）

图3 实验组（HE染色，400×）

3.2 PLC-γ1在各组大鼠关节组织中的表达情况

关节滑膜组织PLC-γ1表达组间差异有统计学意义（F=24.711，P<0.01）。模型组大鼠关节滑膜组织中PLC-γ1的相对表达量明显高于空白对照组（P<0.01），实验组PLC-γ1的相对表达量低于模型组（P<0.05）。 见表 2。

4 讨论

PLC是参与调控细胞的增值分化等细胞代谢活动的重要物质之一，通常分为 PLC-β、PLC-γ、PLC-ε 和PLC-δ四大类型，其中每一类型还有亚型，如 PLC-γ分为PLC-γ1和 PLC-γ2两个亚型。PLC-γ1在人体细胞中广泛表达，而 PLC-γ2主要表达于造血干细胞[4]，其结构中含有水解磷酸酰肌醇二磷酸（PIP2）所必需的结构域。它将PIP2水解，产生了二酸基甘油（DAG）和三磷酸肌醇（IP3）这两种第二信使。DAG能够激活蛋白激酶C（PKC），并通过这一途径参与调控许多细胞活动，特别是细胞分化和增殖。IP3能够引起细胞内“钙库”中钙离子（Ca2+）的释放，激活钙调蛋白（CAM）系统，并通过这一途径使得细胞产生相应的生理效应[5]。Wells等[6]应用成纤维细胞、角蛋白细胞、软组织上皮细胞、神经胶质细胞和癌细胞验证了PLC-γ1为生长因子诱导的细胞活动增加所必需。血管内皮生长因子（VEGF）也正是通过与络氨酸激酶（PTK）结合后激活PLC，并通过这一途径参与调控细胞的增殖和分化的，从而诱导血管渗透性，这与血管新生和炎性反应相关[7]。

表2 PLC-γ1在各组大鼠关节组织中的表达情况（±s）

表2 PLC-γ1在各组大鼠关节组织中的表达情况（±s）

注：与空白对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，△P<0.05

组别 只数 PLC-γ1相对表达量空白对照组模型组实验组15 15 15 0.031±0.001 0.125±0.001*0.072±0.001*△

RA的病因至今仍不清楚，但它有可能和一些病原体的感染有关，有研究报道，类风湿关节炎患者出现关节炎症状之前有肠炎沙门菌、肠耶尔森菌、空肠弯曲菌、沙眼衣原体和肺炎衣原体等病原体的感染。这些病原微生物的感染有可能通过小分子非肽抗原、热休克蛋白（HSP）等途径激活T细胞，使其发挥细胞毒作用，导致靶细胞的损伤和破坏[8]。目前普遍认为RA的病理机制是以T细胞为主的多种辅助因子作用的免疫应答反应。有实验表明，PLC-γ1能够在细胞质膜区域锁定LT细胞位点，并与其他信号分子协同累积LAT、GrbZ和PLC等活化 T细胞，证明PLC-γ1的生物学功能在免疫系统中起了重要作用[9]。RA的主要的病理学特征是滑膜的持续性增生、大量炎症细胞浸润、软骨及骨质的破坏，这与病变滑膜组织中成纤维细胞、血管内皮细胞等的增殖、分化和迁移有关。例如，Smith等[10]通过显微注射刺激PLC-γ的SH2和SH3结构区域，能够促进PC12细胞和成纤维细胞生长并调控细胞周期。Bela等[11]认为，目前至少有两种途径参与调节细胞迁移，PLc-γ是通过与细胞内的PTK受体结合，使与受体结合的效应器活化，从而调节细胞迁移。另外，Kassis等[12]应用PLC抑制剂U73122可使体外表皮生长因子（EGF）诱导的人结直肠癌细胞系（LoVo）细胞的活动性明显降低，并抑制其迁移。

综上所述，运用犀角地黄汤治疗RA急性期有效缓解患者症状的作用机制可能在于它可以降低促使与血管新生及组织细胞增生、迁移相关的VEGF、VEGFR2[13]、PLC-γ1的表达，可以对临床用药提供一定的实验参考。

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