异柠檬酸脱氢酶1基因多态性对非洲人群急性白血病患者阿糖胞苷耐药性的影响

王 艳 Amit K Mitra Jatinder K Lamba 姬怀雪

1.徐州医学院附属医院药剂科，江苏徐州 221006；2.美国明尼苏达大学药学院，美国明尼苏达 55108

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一组高度异质性的恶性血液肿瘤。阿糖胞苷是治疗AML最重要的一线化疗药物，能提高患者生存率[1-2]。然而，阿糖胞苷耐药的产生一直是影响AML患者生存率的瓶颈[2]。因此，鉴定影响阿糖胞苷耐药性的关键基因的变异，对于避免阿糖胞苷耐药性的发生有重要作用。异柠檬酸脱氢酶1（isocitrate dehydrogenase1，IDH1）是近期发现的一种NADP依赖型的异柠檬酸脱氢酶[3]。研究发现，IDH1基因突变致与急性白血病的发生与不良预后密切相关[4]。然而，IDH1对非洲人群急性白血病患者阿糖胞苷耐药性的影响目前并不清楚。本研究旨在探讨IDH1对非洲人群AML患者阿糖胞苷耐药性的影响，为提高该人群AML患者阿糖胞苷的疗效，降低不良反应奠定基础。

1 材料和方法

1.1 细胞培养

应用来自国际人类基因组计划60个非洲人（YRI）EBV病毒转化的淋巴母细胞系（lymphoblastoid cell line，LCL）。上述细胞株购自美国Coriell医学研究所。将上述细胞株置于含有L-谷氨酰胺（Lonza Walkersville，Inc.，Walkersville，MD）的 RPMI 1640 培养基中，加15%热灭活血清37℃，5%CO2条件下培养[5]。

1.2 阿糖胞苷的细胞耐药性检测

阿糖胞苷耐药性检测参照文献[6]方法进行。予不同浓度的阿糖胞苷（1，5，40，80 μmol/L）加入细胞中共培养72 h后，应用alamar Blue试剂盒（Biosource international，Camarillo，CA）参照制造商说明书检测细胞存活曲线、细胞增殖和细胞毒性。梯形法计算阿糖胞苷曲线下面积（AUC）判断该药的耐药性（以更高的AUC表示），AUC进行Log2转换后统计分析[6]。

1.3 IDH1基因多态性检测

DNA样本来自HapMap非洲人群的LCL细胞株。参照文献[7]，针对IDH1突变热点区域设计引物，由明尼苏达大学生物医学基因组学中心合成。引物序列如下：

正向：5'CTCAGAGCCTTCGCTTTCTG3'；

反向：5'TTCATACCTTGCTTAATGGGTGT3'。 Taqman PCR反应条件：95℃预变性7 min；然后95℃变性30 s，60℃退火 35 s，72℃延伸 40 s，35 个循环后，70℃延伸10 min，反应产物4℃保存。反应产物经琼脂糖凝胶电泳后出现目的条带样本由明尼苏达大学生物医学基因组学中心直接测序。测序结果在美国国家生物技术信息中心（NCBI）中序列比对（BLAST）比较。

1.4 统计学方法

采用统计软件R软件对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，采用 t检验。连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）与单倍型分析、单倍型人群频率估算采用Haploview 4.2分析。IDH1 SNPs的基因型、最小等位等位基因与阿糖胞苷AUC的分析采用Kruskal-Wallis检验及Wilcox检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

本研究发现，非洲人群样本中，IDH1 rs10173938、rs10192397与阿糖胞苷更高的AUC相关（提示耐药）。其中，IDH1 rs10173938纯合子AA基因型携带者阿糖胞苷的AUC明显高于rs10173938的AC及CC基因型携带者阿糖胞苷的AUC，二者相比差异有统计学意义 [rs10173938：AA 比（AC+CC），P=0.040]。IDH1 rs10192397纯合子TT基因型携带者阿糖胞苷的AUC明显高于与CT及CC基因型携带者阿糖胞苷的AUC，二者相比差异有统计学意义[（rs10192397：（CC+CT）比 TT，P=0.036]。 见表 1。

3 讨论

本研究首次发现，IDH1 的 SNPs（rs10173938、rs10192397）变异与非洲人群AML患者的阿糖胞苷耐药性有关。IDH1 rs10173938纯合子AA基因型携带者阿糖胞苷的AUC明显高于rs10173938的AC及CC基因型携带者阿糖胞苷的AUC（P<0.05）。提示，IDH1 rs10173938纯合子AA基因型携带者对阿糖胞苷耐药可能性大，IDH1 rs10173938的最小等位基因A可能是该部分人群对阿糖胞苷耐药的风险因子。IDH1 rs10192397纯合子TT基因型携带者阿糖胞苷的AUC明显高于与CT及CC基因型携带者阿糖胞苷的AUC（P<0.05）。提示，纯合子TT基因型携带者阿糖胞苷耐药可能性大，IDH1 rs10192397的最小等位基因T可能是该部分人群对阿糖胞苷耐药的风险因子。具体的功能及意义在进一步研究中。

表1 非洲人群IDH1单核苷酸多态性对阿糖胞苷AUC的影响（±s，n=60）

表1 非洲人群IDH1单核苷酸多态性对阿糖胞苷AUC的影响（±s，n=60）

注：P1为 AA 比（AC+CC）；P2为（CC+CT）比 TT

rs10173938 rs10192397内显子内显子AA（n=16）AC（n=32）CC（n=9）CC（n=13）CT（n=34）TT（n=13）3295.371±658.214 2833.301±497.002 3195.382±776.748 2857.324±540.578 2780.298±630.892 3285.368±585.815 P1=0.040 P2=0.036 rs编号 定位 基因型 阿糖胞苷曲线下面积 P值

IDH1基因突变是急性白血病的发生及不良预后的重要因素。IDH1密码子132R的突变能诱发细胞因子自主性，阻碍造血干细胞分化，诱导AML发生[7-8]。近期文献发现，携带有IDH1密码子132R和IDH2密码子R172突变基因的正常核型急性髓细胞白血病（CN-AML）患者或同时伴有IDH及NPM1变异的老年CN-AML患者应用阿糖胞苷化疗后易发生阿糖胞苷耐药，完全缓解率降低[9-10]。本研究发现，IDH1的SNPs（rs10173938、rs10192397）与非洲人群样本中阿糖胞苷的耐药性有关。进一步证明，IDH1基因突变是导致AML患者不同的预后及阿糖胞苷耐药发生的重要因素。具体功能及机制需要大样本研究进行证实。

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