陕南薇菜中黄酮类化合物的提取及其抗氧化性研究

袁 亮，李开龙，温松成，刘 欢，夏发军，杨海涛

(陕西理工学院 化学与环境科学学院，陕西 汉中 723000)

薇菜是紫萁科多年生草本蕨类植物，其嫩叶含蛋白质、碳水化合物及钙、磷等多种成分，其中的黄酮类化合物是广泛存在于自然界的一大类多苯环化合物，主要成分芦丁在生物体内具有抗癌、抗菌、抗炎、抗过敏、抗血管脆性和血小板聚集及抗糖尿病并发症等多种生理活性及药理作用。此外，黄酮具有抗氧化作用，可以增强肝细胞抗氧化酶活性，稳定线粒体膜电位，减少活性氧产生，其毒性远低于合成氧化剂［1］。调查显示:薇菜总黄酮还原能力较强，可以清除 O2－·、·OH 和 DPPH·自由基，且对脂质过氧化的抑制活性较强［2］。本实验将通过正交试验的方法，探究薇菜中黄酮类化合物提取的最佳工艺，为其进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 试材

新鲜的薇菜，采自陕西省南郑县汉山镇，自然风干后粉碎，过50目筛，于50℃烘箱干燥至恒重后备用。

1．1．2 主要试剂

芦丁标准样品(自制)。

无水乙醇、可溶性淀粉、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、硫代硫酸钠、碘化钾、硫酸、过氧化氢等均为分析纯。

1．1．3 主要仪器

722-E型紫外可见分光光度计(上海天普分析仪器有限公司)，FA-2004型电子分析天平(上海方瑞仪器有限公司)，DL-5型低速大容量离心机(北京时代北利离心机有限公司)，JH-9052型恒温箱(中国重庆实验设备厂)，HH-Z型恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器公司)和SHZ-Ⅲ型真空泵(西安明克斯检测设备有限公司)。

1．2 实验方法

1．2．1 薇菜中黄酮类化合物的提取流程

根据相似相溶的原理，把在乙醇中溶解度较大的黄酮类化合物从薇菜中分离出来，再利用离心分离祛除色素、蛋白质、胶体等大分子物质，其工艺流程如下:薇菜→烘箱烘干→碾碎→称取适量→于恒温水浴浸提→过滤→离心→定容→取上清液→测定吸光度［3］。

1．2．2 薇菜中黄酮类化合物的提取

取2.5 g薇菜干粉，在温度、乙醇浓度以及料液比不同的情况下进行恒温水浴，提取一段时间后过滤，所得溶液经离心后，用50 mL的容量瓶进行定容。

1．2．3 芦丁标准曲线的绘制

精确称取经干燥至恒重芦丁标准品20.0 mg，加乙醇溶解并定容至50 mL，配成0.4 mg/mL的芦丁标准溶液。准确吸取标准品溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00 mL，分别加乙醇补至10.00 mL，加5%亚硝酸钠溶液1.5 mL，摇匀，静置6 min，加10%的硝酸铝溶液1.5 mL，摇匀，静置6 min，加4%的氢氧化钠溶液15 mL，用乙醇稀释至刻度，摇匀，放置15 min，在波长510 nm处测定吸光度，以芦丁浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线。得到回归方程为:A=10.618C －0.0036，r=0.9952。

1．2．4 薇菜样品总黄酮含量的测定

采用 NaNO2-Al(NO3)3比色法［4］，在 510 nm 处测定。

1．2．5 单因素实验

设计温度、浸提时间、乙醇浓度、料液比4个因素，分别进行3个水平的单因素实验，确定最佳提取条件。

1．2．6 正交试验

参照单因素实验结果，设计4个因素3个水平的正交试验，研究最佳提取工艺，见表1。

表1 正交试验的因素水平

1．2．7 验证实验

称取样品薇菜粉末3份，每份2.50 g，按最优工艺条件进行总黄酮提取的验证实验，测定和计算黄酮的得率。

1．2．8 抗氧化性实验

抗氧化值(artillery observation vehicle，AOV)的测定:利用过氧化氢与碘化钾反应生成碘，再用硫代硫酸钠滴定碘，设置空白对照就可以直接测定黄酮类化合物的抗氧化值。分别取不同浓度的薇菜黄酮提取液10 mL于三角瓶中，加入1 mol/L的硫酸0.25 ml和0.25 mol/L的H2O25 mL，室温下反应10 min，再加入质量分数10%的碘化钾溶液20 mL，静置5 min后，用0.05 mol/L硫代硫酸钠溶液进行滴定，以质量分数为1%淀粉溶液指示终点，同时用空白做对照，平行做三组，测定其平均值［5］。

2 结果与分析

2．1 单因素实验

2．1．1 乙醇浓度对提取率的影响

称取2.50 g薇菜样品，按照1∶20的料液比分别加入浓度为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，于65℃恒温水浴中浸提1.5 h，过滤，离心，测定其黄酮的含量，结果见图1。

图1 乙醇浓度对提取率的影响

由图1可以看出，随着乙醇浓度的升高，得率升高，但当乙醇浓度大于80%时，得率呈下降趋势，可见乙醇浓度在80%左右时，提取率最高。

2．1．2 提取时间对提取率的影响

称取2.50 g的薇菜样品，按1∶20的料液比加入浓度为80%的乙醇，在65℃ 恒温水浴中分别浸提 1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h，过滤，离心，测定其黄酮的含量，结果见图2。

图2 提取时间对提取率的影响

由图2可见，随着时间的延长，得率升高，但1.5 h以后，得率呈下降趋势，所以当提取1.5 h时，提取率最高。

2．1．3 料液比对提取率的影响

称取2.50 g的薇菜样品，分别加入料液比为1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30 的 80% 的乙醇，于65℃ 恒温水浴浸提1.5 h，过滤，离心，测定其黄酮的含量，结果见图3。

图3 料液比对提取率的影响

由图3可见，随着溶剂量的增加，提取率逐渐升高，但当料液比达到1∶25左右时，提取率最高。

2．1．4 提取温度对提取率的影响

称取2.50 g的薇菜样品，按1∶25的料液比加入浓度为80%的乙醇，分别在60℃、65℃、70℃、75℃、80℃的恒温水浴下浸提1.5 h，过滤，离心，测定其黄酮的含量，结果见图4。

图4 提取温度对提取率的影响

由图4可见，黄酮的提取率随着温度的升高而升高，但在65℃以上时，曲线呈下降趋势，所以在65℃ 时，提取率最高。

2．2 黄酮提取的正交试验

为确定乙醇提取工艺的最佳条件，设计如下正交试验表进行实验。

表2 正交试验结果

由表2可知:各因素的影响大小为提取时间＞温度＞料液比＞乙醇浓度;最佳的提取条件为A2B1C2D2，即提取时间为1.5 h，提取温度为65℃，料液比为1∶25，乙醇浓度为80%。

2．3 验证实验

验证实验结果表明，总黄酮的平均得率为15.723 mg/g，高于正交实验方案中的所有组合，说明工艺优化成功。

2．4 抗氧化活性分析

根据公式 AOV=(V0－V1)×M ×34/0.1，式中，V0为空白对照消耗硫代硫酸钠的体积，V1为样品溶液消耗硫代硫酸钠的体积，M为硫代硫酸钠的摩尔浓度0.05 mol/L，34为过氧化氢的摩尔浓度，0.1为常数，研究结果如图5所示。

图5 黄酮浓度对抗氧化值的影响

由图5可以看出，在低浓度时，黄酮类化合物的抗氧化值随其浓度的升高而升高，但当黄酮类化合物的浓度继续升高时，曲线趋于平缓。这就是说，黄酮类化合物的抗氧化值随其浓度的升高而升高，且先快后慢。

3 结论

薇菜中黄酮类化合物提取的最佳工艺条件为:乙醇的浓度为80%，料液比为1∶25，提取时间为1.5 h，温度为65℃，在该条件下的得率为15.723 mg/g。

薇菜中黄酮类化合物具有一定的抗氧化性，且随着添加量的增加，抗氧化作用增强，最后趋于平缓，达到最大值。

［1］陆柏益，张英，吴晓琴．竹叶黄酮的抗氧化性及其心脑血管药理活性研究进展［J］．林产化学与工业，2005，25(3):120－124．

［2］童欣欣，方琴，陈静波．四种常食用野菜总黄酮的测定及抗氧化活性的研究［J］．粮油食品科技，2010，18(5):43－46．

［3］游见明．生姜黄酮的提取方法比较［J］．四川食品与发酵，2005，2(4):88 －89．

［4］刘艳芳，杨焱，贾薇，等．药用真菌桑黄总黄酮测定方法研究［J］．食用菌学报，2006，13(2):45 －52．

［5］张灿，张海晖，武妍．马兰黄酮类化合物的提取及其抗氧化活性［J］．农业工程学报，2011，27(2):307 －311．