莲藕品种对莲藕汁抗氧化性的影响——莲藕汁的抗氧化性研究之一

王 蓓

(江苏省扬州商务高等职业学校 烹饪系，江苏 扬州 225127)

研究表明，莲藕汁的成分复杂，而且其种类和含量随莲藕品种、产地、气候和加工方法等因素的变化而变化。迄今为止，在莲藕的主要抗氧化活性成分的认识上还存在一定的分歧。莲藕类食品经过榨汁、均质、灭菌等一系列加工工艺和贮藏后，其中的活性物质损耗很大。因此，如何最大限度地保留对人体有功能活性的有效成分，是提高莲藕汁产品质量、增加产品附加值的关键。

本实验以莲藕为试材，测定了不同莲藕品种果汁中主要活性成分的含量，并采用不同抗氧化体系对其抗氧化活性进行综合评价，分析其抗氧化活性与主要活性成分的相关性，以期为莲藕加工及其综合开发利用提供理论依据和实践参考。

1 鲜莲藕汁制备方法

选取4种鲜莲藕，每个品种制备成约100 mL的莲藕汁。具体方法为:洗净，拭干，用家用榨汁器榨出藕汁，经100目干净纱布过滤盛于烧杯中，将榨汁后的藕渣放入洁净纱布中，再将藕汁全部压出，合并于烧杯中，搅匀，在－18℃保存待用。市售藕汁类饮料打开包装后直接用于分析。

2 指标测定方法

2．1 活性成分含量测定方法

2．1．1 总多酚含量测定［1］

在碱性溶液中，多酚类化合物可以将钨钼酸还原(W6+变为W3+)生成蓝色化合物，在760 nm处有最大吸收，颜色的深浅与多酚含量呈正相关。一般用没食子酸(或焦性没食子酸)作为参照标准，提取物中总多酚的含量以等同于没食子酸(gallic acid equivalent)的量表示。

准确称取真空干燥至恒重的焦性没食子酸标准品44.3 mg，用水溶解定容至100 mL，分别取2.0、4.0、8.0、12.0、16.0 和 20.0 mL 于 100 mL 容量瓶中，用水稀释至刻度。再分别取上述不同浓度溶液1 mL加到10 mL比色管中，然后依次加入1 mL去离子水、0.5 mL已稀释2倍的福林酚试液、1.5 mL 26.7%的Na2CO3溶液，用水定容至10 mL，室温下反应2 h，于760 nm下测定吸光值。以吸光值对标样含量作图，得到典型的标准曲线。

取2 mL鲜藕汁于带塞试管中，加5 mL含1.2 mol/L HCl的甲醇/(1+1)提取，旋涡振荡1 min后于90℃处理3 h，每30 min旋涡振荡一次。冷却后用甲醇稀释至10 mL，在4000×g下离心5 min后测定，方法同标准曲线的制作。按下式计算结果:

式中:X为藕汁中总多酚含量，mg/100 mL;C为从标准曲线查出或用回归方程计算出的样液中总多酚含量，mg/mL;V1为测定的取用样液体积，mL;V2为取用样液总体积，mL。

2．1．2 儿茶素、没食子酸、咖啡酸、多巴、儿茶酚测定

精确称取各标准样品100 mg，用甲醇溶解定容到10 mL的棕色容量瓶中，作为工作母液备用。分别准确吸取上述标准液 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mL，用甲醇稀释定容到50 mL的棕色容量瓶中，配制成10～100 mL/L的混标准液，用0.45 μm的滤膜过滤后，上机绘制五种酚类物质的标准曲线。

取10 mL果汁，用10 mL乙醚萃取3次，有机相用旋转蒸发器(真空，＜35℃)浓缩至干滤。

高效液相色谱操作条件。

色谱柱:DiamonsilTM(钻石)C18柱(5u250×4.6 mm);

流动相:A，甲醇 +乙酸+水(10∶2∶88);B，甲醇+乙酸+水(90∶2∶8);

流速:1.0 mL/min;

进样体积:20 μL;

检测双波长:280 nm和320 nm;

柱温:30℃。

表1 HPLC法梯度洗脱程序

2．1．3 维生素C测定

精确称取100 mg抗坏血酸，用0.1%草酸溶液定容至100 mL，作为工作母液备用。准确吸取2.0、4.0、6.0、8.0 mL 母液稀释至 25 mL，用 0.45 μm 滤膜过滤后，上机绘制标准曲线。

取1 mL藕汁加10 mL 0.1%的草酸稀释，经0.45 μm微孔滤膜过滤后上机测定。

高效液相色谱操作条件。

色谱柱:DiamonsilTM(钻石)C18柱(5u250×4.6 mm);

流动相:甲醇 ∶磷酸二氢钾缓冲液 =75∶25(pH=4.0);

流速:1.0 mL/min;

进样体积:20 μL;

检测波长:266 nm;

柱温:25℃。

2．1．4 总类胡萝卜素测定［2］

样品通过石油醚一丙酮(1+0.5)混合溶液萃取，使之与非类胡萝卜素成分分离，在451 nm波长下测定萃取溶液的吸光度，计算出样品中总类胡萝卜素的含量。取5 mL果汁于25 mL具塞试管中，加10 mL石油醚一丙酮(1+0.5)混合液，振荡提取，将提取液(上层有机部分)过滤至100 mL三角瓶中，如此反复提取3～4次，直至样品提取液无色，将几次滤液从三角瓶转移至250 mL梨形分液漏斗中，并用水洗涤石油醚层，出现乳化时，加饱和 NaCl 3～5 mL，剧烈振荡，待液相分层后弃去下层水相，重复2～3次，将石油醚层定量转移至50 mL容量瓶中，用无水硫酸钠过滤，以石油醚定容，摇匀，用1 cm比色皿以石油醚作空白，在451 nm处测定吸光值。按下式计算结果:

式中:X为果汁中总类胡萝卜素含量(以β胡萝卜素计)，mg/100 mL;E为样品在451 nm处的吸光度;E1为1% β胡萝卜素石油醚溶液在451 nm波长下的消光值，即2500;V1为样品总类胡萝卜素提取液体积，mL;V2为取用样液总体积，mL。

2．2 抗氧化能力测定方法

于5 mL藕汁中加入25 mL 50%乙醇，旋涡振荡1 min后，用超声波处理10 min，过滤备用。

2．2．1 羟基(·OH)自由基清除率的测定方法［3］

Fenton反应是生物体内产生·OH的主要反应，其反应式可表示为:Fe2++H2O2→Fe3++OH－+·OH，用比色分析法测定Fenton反应体系产生的·OH，其中邻菲罗啉与Fe2+是该反应中一种常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变，如果向反应加入·OH的清除剂，则·OH减少，同时Fe2+增多，溶液颜色变红，由此可推算·OH清除剂对·OH的清除效率。实验按下表分组，试剂从表左至表右依次加入试管:

表2 羟基(·OH)自由基清除率分组测定表

反应在37℃恒温水浴中进行，准确反应1.5 h后，以AK为空白对照，迅速测定536 nm处的吸光值。按下式计算样品对·OH的清除率:

2．2．2 对 DPPH·清除能力实验［4］

实验按表3分组，加入96孔微量滴定板的每孔中。

表3 DPPH·清除能力分组实验表

每个处理重复3次，震荡摇匀后于室温下放置30 min，用酶标仪测定各孔在517 nm处的吸光值，A0为空白对照值，Ai为样品值，Aj为本底值。按下式计算样品对DPPH·的抑制率:

2．2．3 ABTS 法测定总抗氧化能力［5］

ABTS经活性氧氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS·+，向其中加入被测物质，如果该物质中存在抗氧化成分，则会与ABTS·+发生反应而使反应体系褪色，然后在ABTS·+这种自由基的最大吸光波长下检测吸光度的变化，与含Trolox的对照标准体系比较，换算出被测物质总的抗氧化能力。将7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L K2S2O8溶液等体积混合，在室温、避光的条件下静置过夜，形成ABTS·+自由基储备液，使用前用80%乙醇稀释成工作液，使其在室温下于414 nm波长下的吸光度为0.070±0.020。测定时在96孔微量滴定板的每孔中加入390 μL 的 ABTS·+工作液，再加入 10 μL 的标准物质或藕汁提取液，以400 μL的80%乙醇为空白，混合10 s，于16 min后读取414 nm波长下的吸光度。使用的Trolox参照物标准系列为0.20 mmol/L、0.40 mmol/L、0.60 mmol/L、0.80 mmol/L 和1.00 mmol/L。将标准物质或样品提取液清除自由基的能力与Trolox清除自由基的能力相对比，确定其相对抗氧化活性，单位为TEAC，即1 mmol/L标准物质清除自由基能力相当于Trolox清除同等自由基能力的毫摩尔数，或是100 mL果汁清除自由基能力相当于Trolox清除同等自由基能力的毫摩尔数。按下式计算样品的TEAC值:

式中:TEAC为Trolox当量值，mmol/L;ΔA为加入样品提取液后反应体系吸光度变化值;CTrolox为Trolox标准溶液浓度，mmol/L;ΔATrolox为加入相同体积Trolox后从其标准变化曲线上查得的吸光度变化值;V为样品提取液体积，mL;V0为取用样液总体积，mL。

3 结果与分析

3．1 莲藕品种对鲜藕汁抗氧化性的影响

3．1．1 品种对活性成分的影响

4个莲藕品种中的VC、总多酚、总类胡萝卜素含量见表4，儿茶素、没食子酸、咖啡酸、多巴、儿茶酚含量见表5。从表4可以看出，VC的含量介于178.6～290.6 mg·L－1，目前尚未见到相关的数据。多酚类含量介于573.1～655.0 mg·L－1，此数据可能与实际测得值有些许差异，这与莲藕品种、产地以及测定方法有关，各品种间这两类活性成分的含量呈现一定差异，但差异不大。较前两类活性成分而言，总类胡萝卜素含量相对较低，介于5.47～7.25 mg·L－1。

表4 不同莲藕品种果汁中VC、多酚、总类胡萝卜素含量

表5 不同莲藕品种果汁中儿茶素、没食子酸、咖啡酸、多巴、儿茶酚含量

莲藕中的多酚类主要是类黄酮和咖啡酸、绿原酸、p-羟基苯甲酸、没食子酸等，这些物质在各品种间的含量无过大差异。

3．1．2 品种对抗氧化能力的影响

3．1．2．1 4 个莲藕品种的·OH 和 DPPH·清除能力及与各活性成分含量的关系

羟自由基(·OH)是化学性质最活泼的活性氧物种，其反应特点是无专一性，且反应速率快，可以使非自由基反应物变成自由基，由氧化应激所造成的损害几乎全部是由·OH中介的，被公认是最活泼也是最具危害性的自由基。采用Fenton反应比色法测定4个莲藕品种对·OH的清除效果(见表6)。由表6可以看出，4个莲藕品种对·OH的清除率介于37.60% ～58.62%，各品种间存在的差异不明显，其中，以拿麻种清除能力最强，鄂莲5号最弱。

表6 不同莲藕品种清除自由基能力的比较

DPPH法因具有快速、简单、灵敏、直接的优点，在当前被广泛应用来测定物质总的抗氧化能力。从表6可以看出，各莲藕品种都表现出较强清除DPPH·能力，清除率均在54%以上，比平均值58.16%略低些，这可能与品种及品种栽境、活性成分提取方法有关。各品种在清除DPPH·时未表现出显著的差异性。

对·OH、DPPH·两种自由基清除能力强的品种，VC和多酚类含量都相对较高(见表7)。通过分析相关统计结果可知，各品种对两种自由基的清除能力与VC含量呈正相关(r=0.645，P=0.118;r=0.545，P=0.206)，与多酚含量也呈正相关(r=0.598，P=0.156;r=0.799，P=0.031)，与总类胡萝卜素含量存在一定的正相关(r=0.620，P=0.137;r=0.755，P=0.050)，其中 DPPH·清除率与多酚含量和总类胡萝卜素含量均达到显著水平(P＜0.05)，这些相关性从图1中各线型趋势也可明显看出。另外，不同品种间VC和多酚类含量之间达到极显著水平(r=0.919，P＜0.01)。为明确两者之间在清除自由基时是否存在干扰，进行了偏相关分析，结果见表8。对比表7和表8发现，VC和多酚类含量间存在的相关性在清除两种自由基时表现出增效作用，这可能与两类物质在与自由基反应时出现的某些关联性反应有一定关系。

表7 不同莲藕品种对自由基清除能力与VC、多酚、总类胡萝卜素含量的关系

表8 不同莲藕品种对自由基清除能力与VC、多酚类含量的偏相关性

图1 自由基清除率与VC含量的关系

图2 自由基清除率与总类胡萝卜素含量的关系

图3 自由基清除率与多酚类含量的关系

3．1．2．2 4 个莲藕品种的 TEAC 值及 VC、多酚类、总类胡萝卜素的相对贡献率

本节用ABTS/K2S2O8体系测定了反映TAA的TEAC值，进行了相关分析，计算了各抗氧化活性成分对TAA的相对贡献率。

首先测定了藕汁中存在的主要抗氧化活性成分的TEAC值，结果是:VC0.56 mmol/L，焦性没食子酸3.09 mmol/L，总类胡萝卜素0.59 mmol/L，并据此计算各成分对TAA的相对贡献率，结果见表9。

总体而言，所测定的4个莲藕品种的抗氧化活性都比较好，其中拿麻种相对最强，TEAC值达到6.09，其次是鄂莲4号和鄂莲5号，TEAC值分别是5.47和5.19;东河早藕最低，TEAC值为4.03。从表9可以看出，在所测定的4个莲藕品种中，多酚类对总抗氧化活性的贡献率最大，介于58.35% ～63.69%;VC的贡献率次之，介于30.03% ～37.65%，为多酚类的一半;总类胡萝卜素的贡献率最低。

表9 不同莲藕品种的TEAC值及各活性成分对TAA的相对贡献率

表10列出了不同莲藕品种的TEAC值与VC、多酚、总类胡萝卜素含量的关系，其中TEAC值与VC含量达到显著水平(r=0.868，P=0.011)，与多酚类含量达到极显著水平(r=0.909，P=0.005)，与总类胡萝卜素含量之间的相关性不明显(P＞0.1)。由此可见，多酚类物质可能是莲藕品种中主导的抗氧化活性成分。

表10 不同莲藕品种的TEAC值与VC、多酚、总类胡萝卜素含量的关系

综合比较4个莲藕品种对·OH和DPPH·两种自由基的清除能力及其TEAC值，发现拿麻种品种清除效果较好，TEAC值最高。

4 结论、创新与展望

4．1 结论

4个莲藕品种果汁中Vc的含量介于178.6～290.6 mg·L－1，多酚类含量介于573.1 ～655.2 mg·L－1，总类胡萝卜素含量介于5.47～7.25 mg·L－1，Vc与多酚这两大类活性成分含量在品种间的差异较为明显，均以拿麻种含量最高，总类胡萝卜素含量在品种间的差异不明显。

4个莲藕品种对·OH的清除率介于37.60% ～58.62%，品种间存在显著的差异性;对·DPPH的清除率均在50%以上，品种间未呈现显著的差异性，拿麻种清除率相对较高。用ABTS/K2520体系测定的反映总抗氧化能力的TEAC值介于4.03～6.09，拿麻种最高，东河早藕最低。综合比较表明，拿麻种品种总抗氧化能力最强。

统计分析表明，各品种对·OH和·DPPH两种自由基的清除能力与Vc、多酚及总类胡萝卜素含量之间存在正相关，其中与Vc的相关度达到显著水平(r=0.868，P=0.011)，与多酚类的相关度达到极显著水平(r=0.909，P=0.005)，而与总类胡萝卜素则无显著相关关系(P＞0.1)，这表明多酚类物质可能是莲藕品种中主导的抗氧化活性成分。

本研究从莲藕抗氧化活性的角度出发，运用快速、简便、灵敏的ABTS检测法，比较了不同莲藕品种的总抗氧化能力，为提高果汁产品的质量、增加产品的附加值提供了一定的理论依据。

4．2 创新与展望

随着科学技术的不断发展和人们健康意识的不断提高，人们越来越重视天然抗氧化活性物质。本研究发现，莲藕类具有较强的抗氧化活性，并借鉴前人的提取方法测定了多酚类、VC及胡萝卜素类主要抗氧化活性成分。但由于提取方法的限制，可能还有一些活性物质被遗漏。可以考虑提纯这些天然抗氧化成分和植物活性成分，并将其添加到食物中作为膳食补充剂，以满足不同消费者的需求。

［1］凌关庭．抗氧化食品与健康［M］．北京:气象出版社，2004，1．

［2］韩雅珊．食品化学实验指导［M］．北京:中国农业大学出版社，1996．

［3］Kurowska E M，Ph D，Borradaile N M．Hyplcholesterolemic effects of dietary citrus juices in rabbits［J］．Nutrition Research，2000，20(1):121 －122．

［4］彭长连，陈少薇，林植芳，等．用清除自由基DPPH法评价植物抗氧化能力［J］．生物化学与生物物理进展，2000，27(6):658－661．

［5］韩光亮，李翠梅，Eduardo Cacace，等．改良的 ABTS+法及其在优化抗氧化活性物质提取中的应用［J］．卫生研究，2004，33(5):620 －622．