梗阻性黄疸大鼠血清IL-6、TNF-α 及肝脏Kuppfer 细胞CD14表达变化

张金敏，郑世华，仝巧云

(三峡大学第一临床医学院，宜昌市中心人民医院，湖北宜昌 443003)

黄疸患者免疫力低下，易发生内毒素血症、肠黏膜屏障功能障碍、肝肾功能不全甚至多器官衰竭，病死率高［1～3］。内毒素受体CD14是机体免疫反应过程中的关键因素之一，能识别血中的内毒素脂多糖(LPS)并与其结合，从而诱发免疫细胞的一系列信号转导过程，诱导IL-6、TNF-α 等细胞因子的表达，产生炎症瀑布效应［2］。2012年9月，我们建立了梗阻性黄疸(OJ)大鼠模型，观察了其血清IL-6、TNF-α水平及肝脏Kuppfer 细胞CD14的表达变化，旨在探讨黄疸性肝损伤的免疫机制。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物:清洁级雄性SD 大鼠60 只，体质量320～360 g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。主要试剂:大鼠IL-6 和TNF-α 酶联免疫试剂盒为美国RapidBio 公司产品，兔抗大鼠CD14多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 动物分组及OJ 模型制作 将60 只大鼠随机分为三组各20 只，其中黄疸组术前禁食12 h、禁水4 h，3%戊巴比妥钠(60 mg/kg)腹腔注射麻醉，取剑突下正中部切口，双重结扎切断胆管，制成OJ 模型;假手术组仅开腹分离胆管，但不结扎切断;对照组不做特殊处理。

1.3 标本采集 三组均于7 d 后以3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，以无菌注射器抽取下腔静脉血1 mL 置于无菌EP 管中，同时取1 cm ×1 cm ×1 cm 大小肝脏组织以4%多聚甲醛固定，制备石蜡切片。

1.4 血清IL-6 及TNF-α 水平测定 将下腔静脉血低温高速离心(3 000 r/min，4 ℃，10 min)，取血浆，采用ELISA 法测定血清IL-6 及TNF-α 质量浓度。

1.5 肝脏Kuppfer 细胞CD14表达检测 取上述肝脏组织石蜡切片进行脱蜡、脱水处理，以1∶200的兔抗大鼠CD14多克隆抗体为一抗，以HRP 标记的羊抗兔IgG 抗体为二抗进行免疫组化检测，通过显微图像分析技术，测定CD14阳性反应物(CD14为细胞膜着色，呈棕黄色，主要表现为肝窦边缘及汇管区的星形细胞即Kuppfer 细胞阳性表达)的平均积分光密度值(IOD/area)，其中IOD 为待测定区域阳性染色的积分光密度，area 为待测定区域的面积，每张切片随即选取5个视野，取其平均值。

1.6 统计学方法 采用SPSS13.0 统计软件。计量资料以±s 表示，两组间比较用成组t 检验，多组间比较采用单因素方差分析。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血清IL-6 及TNF-α 水平比较 与假手术组及对照组比较，黄疸组血清IL-6 及TNF-α 水平均显著升高(P 均＜0.05)，前两组比较无显著差异(P＞0.05)。详见表1。

2.2 三组肝脏Kuppfer 细胞CD14表达比较 黄疸组、假手术组及对照组肝脏Kuppfer 细胞CD14表达的IOD/area 依次为0.016 5±0.001 9、0.001 2±0.000 7、0.001 2±0.000 8，黄疸组显著强于后两组，P 均＜0.01。详见图1。

表1 三组血清IL-6 及TNF-α 水平比较(pg/mL，±s)

表1 三组血清IL-6 及TNF-α 水平比较(pg/mL，±s)

图1 三组肝脏Kuppfer 细胞CD14表达情况

3 讨论

黄疸是胆道疾病最常见的临床表现之一，是指各种原因致肝内胆管、肝总管、胆总管等部分或全部阻塞，胆汁无法引流进入肠道而出现的临床症状。黄疸患者因易发生各种感染、胃肠道出血甚至多器官衰竭而具有较高的病死率。研究［1，3，4］表明，内毒素血症是造成黄疸患者免疫功能损伤的主要因素，黄疸时肠黏膜屏障的解剖结构和功能完整性遭到破坏，易发生肠源性细菌移位;更重要的是此时肝脏Kuppfer 细胞的免疫功能受到抑制，清除内毒素的能力下降，从而容易导致内毒素血症形成［5］。在LPS刺激下，Kuppfer 细胞发生一系列级联反应，引起机体损伤;加之炎症细胞因子过量产生，从而使机体免疫功能受损［4，6］。

IL-6 和TNF-α 是机体重要的炎性细胞因子，主要由激活的单核巨噬细胞系统产生，由于肝脏Kuppfer 细胞占网状内皮系统(RES)的90%左右，血清IL-6 和TNF-α 水平一定程度上也可反映Kuppfer 细胞受刺激的状态［7］。内毒素受体CD14是机体免疫反应过程中的关键因素之一。在肝脏CD14主要表达于Kupffer 细胞，肝细胞也有少量表达。CD14可识别血中的LPS 并与其结合引发免疫细胞的一系列信号转导过程，激活NF-κB 等转录因子，进而诱导众多炎症相关特异基因表达TNF-α、IL-6 等炎性细胞因子［3］。本研究显示，与假手术组及对照组比较，黄疸组血清IL-6 及TNF-α 均显著升高，前两组比较无显著差异。可能机制:OJ 形成可促发细胞因子的级联反应，形成所谓的“瀑布效应”;而异常升高的IL-6 和TNF-α 可与其他炎性细胞因子协同激活肝脏内的磷脂酶，分解磷脂为花生四烯酸，产生对肝细胞有毒性作用的白三烯和超氧自由基，最终导致肝细胞损伤。

Kupffer 细胞是肝脏表达CD14的主要细胞，因而大鼠肝脏组织CD14的表达变化能反映Kupffer细胞CD14表达情况。国外学者的研究［8，9］显示，OJ 时肝脏Kuppfer 细胞数量增多，且CD14表达增强，对内毒素刺激敏感性增强，可能通过一系列的信号转导促进产生和释放包括IL-6、TNF-α 在内的大量细胞因子。Miyaso 等［10］报道，黄疸时Kupffer 细胞CD14表达明显增强，并认为高表达的CD14与内毒素的刺激作用有关。LPS 既是CD14的配体又是CD14表达的激活因素，体内实验及体外研究均表明LPS 可上调Kupffer 细胞CD14的表达。资料［11～13］表明，黄疸患者存在着明显的内毒素血症，原因主要有两点:①肠道内毒素吸收增加。一方面，由于胆汁不能排入肠道，失去了胆盐对细菌繁殖的抑制作用，肠道菌群失调，细菌产生的内毒素增加。另一方面，肠黏膜屏障功能破坏，肠道通透性增加，内毒素经肠壁吸收入血增多。②内毒素清除障碍。OJ 时网状内皮系统功能障碍，主要表现为肝内Kupffer 细胞功能降低，大量入血的内毒素不能有效吞噬和降解，致使内毒素溢入体循环。因此，黄疸大鼠Kupffer细胞CD14表达增高是内毒素持续刺激的结果。本研究显示，黄疸组肝脏Kuppfer 细胞CD14表达显著强于假手术组和对照组，后两组无显著差异。提示OJ 大鼠Kupffer 细胞被激活，并介导了对内毒素的免疫及炎症反应;OJ 时大鼠Kupffer细胞CD14表达增高是内毒素持续刺激所导致，其引起炎症介质血清IL-6、TNF-α 等高表达，进而导致肝脏免疫功能受损、引发全身炎症反应。

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