桫椤茎中牡荆素的抑菌活性

李书华，赵琦，成英，刘芳

（1.乐山师范学院化学与生命科学学院，四川乐山 614000；2.成都大学生物产业学院，四川成都 610106）

桫椤茎中牡荆素的抑菌活性

李书华1，赵琦2，成英1，刘芳1

（1.乐山师范学院化学与生命科学学院，四川乐山 614000；2.成都大学生物产业学院，四川成都 610106）

摘 要：从体外试验的角度观察牡荆素的抑菌作用。以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌为供试菌种，采用滤纸片法和试管内药液2倍稀释法测定牡荆素的抑菌圈直径和最低抑菌浓度（Minimal inhibitive concentration，MIC）。牡荆素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均有明显的抑制作用，对大肠杆菌的最低抑菌浓度（MIC）为100 μg/mL，对金色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC）为25 μg/mL，对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度（MIC）为100 μg/mL。牡荆素具有良好的体外抑菌作用。

关键词：牡荆素；抑菌作用；最低抑菌浓度

桫椤（Alsophila spinutosa），又名“树蕨”、“笔筒树”，属蕨类植物门真蕨亚门水龙骨目桫椤科[1]。桫椤的茎干可入药，在中药里被称为龙骨风，在民间多用桫椤茎干治疗皮肤病[2]。弓加文等首次报道桫椤叶甲醇提取物对大肠杆菌有较好的抑制效果，桫椤茎干甲醇提取物对枯草芽孢杆菌有较好的抑制效果[3]。为了进一步明确其抑菌成分，我们对桫椤茎干甲醇提取物的化学成分进行了研究，结果在其正丁醇萃取物中首次分离得到了两个黄酮苷和一个有机酸类化合物：牡荆素（vitexin）、异荭草素（isorientin）和 3，4，6-三羟基-1-环己烯羧酸[4]。通过薄层层析色谱，发现牡荆素是桫椤茎干中含量最高的黄酮类化合物。据药理研究表明：牡荆素具有减轻心肌细胞损伤，保护缺氧复氧心肌细胞等多种药理活性作用[5-7]，但目前尚未见到牡荆素抑菌活性的研究报道。为了进一步拓展对牡荆素药理作用的研究，我们对桫椤茎干中的牡荆素进行了初步的抑菌作用研究。

1 材料和方法

1.1 材料

样品：牡荆素，从桫椤茎干的甲醇提取物中分离得到，通过1H-NMR和13C-NMR鉴定其结构[4]。

菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus sutilis）：乐山师范学院微生物室提供。

培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。

仪器为DHP-9052电热恒温培养箱：中仪国科（北京）科技有限公司；YX-18HM高压灭菌锅：上海郢研科学仪器有限公司；SW-CJ-1FD单人单面洁净工作台：苏州卓越净化设备有限公司；FA2204B分析天平：上海天平仪器厂；MM720微波炉：美的集团。

1.2 方法

1.2.1 不同浓度牡荆素溶液的配制

准确称取500 mg牡荆素转入50 mL容量瓶中，向容量瓶中加入70%的乙醇30 mL，充分振摇，使其溶解，用70%乙醇定容。然后从该溶液中取5.0 mL牡荆素溶液置于50 mL容量瓶中，70%乙醇定容，依法稀释，配制成5种不同浓度的牡荆素溶液，即1.0、10-1、10-2、10-3、10-4mg/mL。

1.2.2 供试菌株的活化

按照无菌操作要求，将3种供试菌株移接入试管斜面培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）上，在37℃的生化培养箱中培养18 h～24 h，重复活化2次～3次。

1.2.3 菌悬液的制备

用接种环各挑取一环菌体分别放入装有10 mL无菌水的试管里，充分振荡10 min，使其混匀，再从该液中取1 mL菌液加入有9 mL无菌水的试管中，依次稀释，制备出三种浓度梯度的菌悬液，即稀释成10倍、100倍和1 000倍3个浓度，备用。

1.2.4 菌悬液浓度的确定

用移液枪精密吸取上述3种不同浓度的菌悬液各4 μL分别滴加于牛肉膏蛋白胨培养基上，涂匀后，放置于37℃生化恒温培养箱中培养36 h。结果发现：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌在稀释100倍的条件下，生长菌落比较均匀，有利于下一步的抑菌试验。

1.2.5 抑菌试验

采用滤纸片法测定牡荆素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌作用[8]。将直径为6 mm的滤纸片灭菌后分别浸泡于5种不同浓度的牡荆素溶液中备用，另外用70%乙醇浸泡的滤纸片为对照。分别在牛肉膏蛋白胨培养基表面加4 μL各种浓度的3种菌液，用涂布器均匀涂布在培养基表面，在无菌室室温放置2 min～5 min后，在标签的相应位置贴上对应的不同浓度牡荆素溶液浸泡的滤纸片，每菌每一浓度重复3次，置于37℃恒温培养箱中培养24 h～48 h后，准确测定其滤纸片周围抑菌圈直径的大小，计算平均直径，结果以mm表示。

1.2.6 最低抑菌浓度（MIC）的测定

采用试管内药液2倍稀释法，即肉汤稀释法[9]，配制成 200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 μg/mL共8个药物浓度系列。另做不含药物的生长对照。将上述试管置于37℃恒温培养箱中培养24 h。取出试管，以不含药物的生长对照管有细菌显著生长的时间为观察和评定MIC的最佳时间，以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的最低抑菌浓度（MIC）。

2 结果与分析

2.1 牡荆素对三种菌的抑制作用

根据1.2.1项下牡荆素溶液的配置方法，得到5种不同浓度的牡荆素溶液，即 1.0、10-1、10-2、10-3、10-4mg/mL；根据1.2.4项试验确定菌悬液浓度为稀释100倍；按照1.2.5项下方法进行抑菌试验，结果如表1。

表1 牡荆素对菌株的平均抑菌圈直径Table 1 The diameters of inhibition zone of the strains

从表1可以看出，对照组对大肠杆菌、金色葡萄球菌和枯草芽包杆菌有微弱的抑制作用，而不同浓度的牡荆素对三种菌则表现出明显的抑制作用，随着牡荆素浓度的增加，其抑菌能力增强，即使在低浓度10-4mg/mL时仍表现出较强的抑菌效果。

2.2 最低抑菌浓度（MIC）的测定

根据1.2.6项下试验方法，通过肉眼观察试验现象，发现牡荆素对大肠杆菌的最低抑菌浓度（MIC）为100 μg/mL，对金色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC）为25 μg/mL，对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度（MIC）为100 μg/mL，由此可知金色葡萄球菌对牡荆素更敏感。

3 小结与讨论

金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，而大肠杆菌和枯草芽孢杆菌则是条件致病菌。牡荆素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均有明显的抑制作用，对大肠杆菌的最低抑菌浓度（MIC）为100 μg/mL，对金色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC）为25 μg/mL，对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度（MIC）为100 μg/mL，金色葡萄球菌对其更敏感，因此，有必要进一步研究该化合物对金色葡萄球菌的抑菌机理，为牡荆素的开发利用提供理论依据。

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[1]秦仁昌.中国植物志(第二卷)[M].北京:科学出版社,1959:298

[2]新乡医学院.中药大辞典[M].上海:上海科技出版社,2001:2402

[3]弓加文,陈封政,李书华．桫椤叶和茎干抑菌活性初探[J].安徽农业科学,2007,35(33):10566

[4]成英,陈封政,何兴金．桫椤茎杆中化合物成分研究[J].安徽农业科学,2011,39(30):18672

[5]Dong L Y,Chen Z W,Guo Y,et al.Mechanisms of vitex in preconditioning effects on cultured neonatal rat cardiomyoeytes with anoxia and reoxygenation[J].Am J Chinese Medicine,2008,36(2):385

[6]董六一,范一菲,邵旭,等．牡荆素对大鼠心肌缺血再灌注损伤诱导细胞凋亡的影响[J]．中成药,2011,33(6):1041

[7]董六一,邵旭,江勤,等.牡荆素对大鼠实验性心肌缺血损伤的保护作用及其机制[J].中草药,2011,42(7):1378

[8]徐叔云,卞如濂,陈修．药理学实验方法学[M].北京:人民卫生出版社,2003:1651

[9]陈奇.中药药理研究方法学[M].北京:人民卫生出版社,1993:259

Antimicrobial Activities of Vitexin from Alsophila spinutosa

LI Shu-hua1，ZHAO Qi2，CHENG Ying1，LIU Fang1
（1.Department of Chemistry and Life Sciences，Leshan Normal University，Leshan 614000，Sichuan，China；2.Institute of Biological Industry ChengDu University，Chengdu 610106，Sichuan，China）

Abstract：To study the antimicrobial activities of vitexin fromAlsophila spinutosa.WithStaphylococcus aureus，Escherichia coliandBacillus sutilisas tested bacterium， the bacteriostatic effects of vitexin fromAlsophila spinulosawere studied by filter paper method and double broth dilution method.The MIC of vitexin onEscherichia coliwas 100μg/mL，the MIC of vitexin onStaphylococcus aureuswas 25μg/mL，and the MIC of vitexin onBacillus sutiliswas 100μg/mL.The vitexin has good bacterostatic action.

Key words：vitexin；bacteriostatic effect；minimal inhibitive concentration

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.14.002

四川省教育厅资助科研项目（13ZA0105）；四川省旅游发展研究中心资助项目（LYM12-36）

李书华（1970—），女（汉），副教授，硕士，研究方向：功能性化学成分。

2013-01-23