静态顶空-气质联用分析淡豆豉中挥发性成分

柴川，于生，崔小兵，张爱华，朱栋，单晨啸，文红梅

（南京中医药大学药学院，江苏南京 210029）

静态顶空-气质联用分析淡豆豉中挥发性成分

柴川，于生，崔小兵，张爱华，朱栋，单晨啸，文红梅*

（南京中医药大学药学院，江苏南京 210029）

摘 要：采用自动化静态顶空（HS）-气质联用（GC-MS）技术对6个批次淡豆豉的挥发性成分进行快速分析鉴定。从测定到的40多种成分中确定了2-丁酮、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、香芹烯等11种共有化合物及2，3，5-三甲基吡嗪、L-乙酸冰片酯、古巴烯、四甲基吡嗪等16种非共有化合物；同时使用峰面积归一化法计算了27种挥发性成分的相对含量，各组分的质量分数存在一定差异。研究表明，使用自动化静态顶空气质联用法测定淡豆豉的挥发性成分快速简便，且在一定程度上促进了淡豆豉挥发性成分的指纹图谱构建，为淡豆豉质量标准的建立提供了参考。

关键词：淡豆豉；挥发性成分；自动化静态顶空；气质联用

豆豉是我国传统的发酵豆制品，按其发酵方式不同可分为咸豆豉与淡豆豉，咸豆豉是一种豆制食品，无明显药用价值；而淡豆豉则是收录于《中国药典》的一味中药，具有解表、除烦，宣发郁热的功效。豆豉具有挥发性成分，能产生特殊的香气，可以增强食欲，促进吸收，常作为发酵调味品，国内外研究者运用气质联用技术分析了咸豆豉中挥发性成分[1-5]，而淡豆豉中挥发性成分未见文献报道。

近年来，顶空分析方法逐渐成为分析工作者研究挥发性成分的重要手段，其中自动化静态顶空方法最为常用，此法针对挥发性较强的成分，直接采集样品上方气体，可以避免基体成分对样品分析的影响[6]，相对于灵敏度高而操作复杂负责的动态顶空而言，更适合研究者对质量标准的考察。

本研究首次采用自动化静态顶空（HS）与气质联用仪（GC-MS）相结合的方法对淡豆豉药材的挥发性成分进行定性定量分析，并对不同批次淡豆豉的挥发性成分进行比较，以建立检测分析淡豆豉挥发性成分的快速便捷的方法，从而促进淡豆豉挥发性成分的指纹图谱构建，为淡豆豉质量标准的建立及药用价值的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

药材采自安徽、江苏、河南三地见表1，经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为淡豆豉药材。

表1 6个批次的淡豆豉药材信息Table 1 Information about 6 batches of semen sojae Preparatum

1.2 仪器设备

6890/5975B型气质联用仪：美国Agilent公司，G1701DAD.03.00.611工作站，G1888顶空自动进器，NIST05标准质谱检索库；高速万能粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 供试品制备

将淡豆豉药材粉碎，过80目筛后，密闭保存备用；精密称取药材粉末4 g于10 mL顶空装样瓶；每一批材料平行准备三份。

1.3.2 仪器条件

色谱条件：色谱柱为美国Agilent公司DB-5 MS（0.25 mm×30 m×0.25 μm）；进样口温度为 180℃；载气为高纯氦气；流速1 mL/min；分流比为20︰ 1；程序升温初始温度为50℃，1℃/min升至60℃，5℃/min升至100℃，25℃/min升至240℃，维持10 min，总分析时间48 min。

质谱条件：电离方式为EI离子源，电子能量70eV；离子源温度为230℃，四级杆温度为150℃，接口温度为280℃；扫描范围为50 amu～600 amu；电子倍增器电压为1 342 V。

顶空分析条件：柱箱温度为80℃，定量管温度为95℃，传输线温度为110℃，样品瓶平衡时间为40 min，样品瓶加压时间为0.15 min，定量环填充时间为0.15 min。

1.3.3 顶空分析条件的考察

样品量的影响：选取2 g（约10 mL顶空瓶1/4体积）、4 g（约 10 mL顶空瓶 1/2体积）、6 g（约 10 mL顶空瓶3/4体积）3种样品量，分别置于10 mL顶空瓶中，平衡温度100℃，平衡时间30 min，顶空进样分析。

顶空平衡温度的影响：在对顶空平衡温度进行优化的过程中，平衡时间固定为30 min，将平衡温度分别设定为 40、60、80、100 ℃。

顶空平衡时间的影响：将淡豆豉的顶空平衡温度固定在80℃，平衡时间分别设定为20、40、60 min，研究不同的顶空平衡时间对实验的影响。

1.3.4 定性与定量方法

定性分析方法：取淡豆豉药材（批号101031）4 g，平行测定3次。依据GC-MS总离子流图，将各色谱峰对应的质谱信息进行人工解析并与NIST05图库检索中的标准谱图对照，匹配度≥80视为鉴定出的挥发性成分。

定量分析方法：取淡豆豉药材（批号101031）4 g，平行测定3次。用峰面积归一化法计算实验所得化合物的质量分数。

2 结果与讨论

2.1 顶空分析条件的考察

影响自动化静态顶空效率的主要因素有样品量、平衡温度和平衡时间等。样品量的多少会影响顶空瓶内挥发性成分的浓度及检测效果；过高的平衡温度或过长的平衡时间都有可能导致热降解等反应或引起一些性质不稳定的挥发性成分会发生热分解、氧化等反应，使得分析灵敏度降低[7]。

2.1.1 样品量的影响

顶空进样分析结果表明，样品量为4 g时测到的挥发性成分丰度最大。最终选择样品量4 g为最佳样品量，置于10 mL顶空瓶中测定淡豆豉挥发性成分。

2.1.2 顶空平衡温度的影响

顶空进样分析结果表明，平衡温度升高，淡豆豉释放出来的挥发性成分的数量与丰度都随之增多，当平衡温度在100℃时挥发性物质的数量与丰度都与80℃无明显区别。最终选择80℃为淡豆豉最佳顶空平衡时间。

2.1.3 顶空平衡时间的影响

顶空进样分析结果表明，随顶空平衡时间的延长，淡豆豉释放出来的挥发性成分增多，在40 min以前，挥发性成分的数量与丰度都随时间的延长而增加；40min以后，挥发性成分已无太大变化。综合考虑效果与效率，选择40 min为淡豆豉最佳顶空平衡时间。

2.2 分析方法精密度的考察

平行测定3次结果（表2）表明，色谱图中16个主要色谱峰的保留时间的相对标准偏差分别为0%～0.16%，峰面积的相对标准偏差分别为1.27%～5.29%。

表2 6个批次淡豆豉药材中27种挥发性成分及其含量测定结果Table 2 The 27 volatile components identified in the 6 batches of semen sojae Preparatum and the quantitative results

2.3 挥发性成分的GC/MS分析

由淡豆豉挥发性成分的GC-MS总离子流图（图1）可见，将各色谱峰对应的质谱图进行人工解析及计算机检索（NIST05），从6个批次药材中检出近40个色谱峰，从中鉴定出了27种挥发性成分（NIST05匹配度≥80），表3将其分为醛类化合物、醇类化合物、酮类化合物、醚类化合物、烃类化合物、酸类化合物、含硫化合物、含氮杂环化合物、酯类化合物、酚类化合物，其中乙醛、甲硫醇、乙醇、丙酮、二甲基乙醛、2-丁酮、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、二甲基二硫、香芹烯、3，7-二甲基-1，6-二丙烯基苯酚共11种化合物是6个批次药材的共有挥发性成分；而二氯甲烷、乙酸、2，3-丁二醇、戊烯醇、1-甲基-4-（1-甲基乙基）-1，4-环己二烯、正己醛、2，3-二甲基吡嗪、双乙酰、二甲基二硫醚、二甲基硫醚、樟脑、2，3，5-三甲基吡嗪、L-乙酸冰片酯、古巴烯、四甲基吡嗪、7H-呋喃[3，2-g][1]苯并吡喃-7-酮共16种化合物能在部分批次中检测到。这27种化合物有些在豆豉、黄豆酱、酱油、腐乳等大豆发酵物中检出[3，8-12]，而大部分化合物，如香芹烯、L-乙酸冰片酯、古巴烯等，暂未被文献报道，本研究认为引起大豆发酵物种挥发性成分差异的因素是多方面的，而发酵方式及辅料的差异从根本上导致了挥发性成分的差异；这些挥发性成分的发现都为进一步研究淡豆豉药材提供了基础，有待与药理学相结合进行后续研究。

图1 淡豆豉GC-MS总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram（TIC）of Semen Sojae Praepatum by GC-MS

2.4 定量分析

表3同时列出了6个批次药材挥发性成分的保留时间和峰面积相对含量，观察共有峰面积的统计结果，不同批次药材的各组分质量分数存在一定程度的差异，例如从药材挥发性成分的种类来看，河南产多于安徽产和江苏产；而不同贮藏时间挥发性成分的种类和含量也存在差异。

表3 淡豆豉测定方法的精密度考察结果Table 3 The precision of the 16 volatile components identified in the semen sojae Preparatum

3 结论

本研究从鉴定出成分种类和含量方面均能表明，自动化静态顶空气质联用法此方法可以快速、简便、准确地对淡豆豉中挥发性物质进行鉴定及定量，在一定程度上弥补了现阶段对淡豆豉挥发性成分研究的空白，同时促进了淡豆豉药材挥发性成分的指纹图谱构建，为淡豆豉质量标准的建立提供了参考；由于发酵方式及辅料的不同，实验所检测出的挥发性成分有异于其他的大豆发酵物质；由于不同来源及不同的采收期、加工方式、存储方式，不同批次淡豆豉药材中的挥发性成分含量也不尽相同[13]，要建立出完整的对质量标准有指导意义的淡豆豉顶空气相指纹图谱，还有待后续对产地、采收时间及加工工艺等条件的研究。

：

[1]Leejeerajumnean A,Duckham S C,Owens J D,et al.Volatile compounds in Bacillus-fermented soybeans[J].Journal of the science of food and agriculture,2001,81(5):525-529

[2]余爱农,杨春海.细菌型豆豉香气成分的研究[J].食品科学,2002,23(12):98-100

[3]黄红霞,孟鸳,康旭,等.顶空固相微萃取-气质联用技术分析传统豆豉中的挥发性成分[J].农产品加工·学刊,2010,22(9):25-29

[4]秦礼康,丁霄霖.传统陈窖豆豉粑和霉菌型豆豉挥发性风味化合物研究[J].食品科学,2005,26(8):275-280

[5]范琳,陶湘林,欧阳晶,等.曲霉型豆豉后发酵过程中挥发性成分的动态变化研究[J].食品科学,2012,33(22):274-277

[6]谭和平,李斌,张云嫦,等.自动化静态顶空-气质联用法测定茶叶香气[J].中国测试,2009,35(4):62-64

[7]廖远熹,王昊阳,郭寅龙,等.中药柴胡挥发性成分的自动化静态顶空-气相色谱-质谱分析[J].质谱学报,2005,26(3):187-192

[8]乔鑫,付雯,乔宇,等.豆酱挥发性风味物质的分析[J].食品科学,2011,32(2):222-226

[9]赵建新,戴小军,田丰伟,等.气相-嗅闻法分析传统豆酱风味活性物质[J].食品科学,2009(20):394-397

[10]严留俊,张艳芳,陶文沂,等.顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法快速测定酱油中的挥发性风味成分[J].色谱,2008,26(3):285-291

[11]黄明泉,孙宝国,陈海涛,等.同时蒸馏萃取结合气质联机分析北京地区红腐乳挥发性成分的研究[J].食品工业科技,2010(7):150-153

[12]王林祥,刘杨岷,王建新.酱油风味成分的分离与鉴定[J].中国调味品,2005(1):45-47

[13]于生,单鸣秋,池玉梅,等.猫爪草药材顶空气相色谱指纹图谱研究[J].江苏中医药,2007,39(4):47-48

Analysis of Volatile Components in Semen Sojae Praepatum with Automatic Static Headspace and Gas Chromatography-Mass Spectrometry

CHAI Chuan，YU Sheng，CUI Xiao-bing，ZHANG Ai-hua，ZHU Dong，SHAN Chen-xiao，WEN Hong-mei*
（Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210029，Jiangsu，China）

Abstract：It was the first report on the volatile components contained in Semen Sojae Praepatum.For the analysis，the Semen Sojae Praepatum was analyzed by automatic static headspace and gas Chromatographymass Spectrometry.A total of 27 compounds were identified in Semen Sojae Praepatum through the computer retrieval on the NIST5 mass spectral library.They consisted of 11 generality components， such as 2-Butanone，Butanal 3-methyl-，Butanal 2-methyl-，Limonene and 16 special components， such as copaene，Pyrazine，tetramethyl-， 2，3，5-Trimethyl-6-ethylpyrazine， Bicyclo[2.2.1]heptan-2-ol，1，7，7-trimethyl-，acetate，（1S-endo）-.Meanwhile， the quantitative analysis was taken using area normalization method，which showed that some difference was detected among six batches of Semen Sojae Praepatum.The results indicated that automatic static headspace and gas chromatography-mass spectrometry was a fast，easy，efficient and accurate method to analyze the volatile components in Semen Sojae Praepatum，and we thought that the findings may promote the fingerprint research of the volatile components in Semen Sojae Praepatum，to provide a scientific basis for the establishment of the quality standard.

Key words：Semen Sojae Praepatum；volatile components；automatic static headspace；gas chromatographymass spectrometry

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.14.023

江苏省高校自然科学基础研究项目“大豆异黄酮雌激素样作用的代谢组学研究”（基金编号08KJB360004）；南京中医药大学青年自然科学基金项目“淡豆豉活性成分及其质量标准的研究”（基金编号12XZR24）作者简介：柴川（1987—），女（汉），助理实验师，硕士研究生，从事药物及食品分析。

文红梅（1965—），女（汉），教授，博士生导师，从事药物分析及代谢研究。

2013-04-01