黄牛毛藓水提液对冬枣轮纹病致病菌抑制效应的初步研究

2015-12-25刘俊华张孝霖

安徽农学通报 2015年23期

关键词：冬枣

刘俊华++张孝霖

摘要：为了初步阐明苔藓植物的抑菌效应，以我国传统药用苔藓植物黄牛毛藓（Ditrichum pallidum）为试验材料，以冬枣轮纹病致病菌大茎点霉为受试菌株，采用菌丝生长速率法对黄牛毛藓配子体水粗提液进行了抑菌作用的初步研究。结果表明：黄牛毛藓水浸提液对大茎点霉有一定程度的抑制作用，且随着黄牛毛藓水浸提液浓度的增加，其抑菌效果愈加明显，在较高浓度（>40mg/mL）条件下，抑菌率达50%以上。因此，黄牛毛藓提取物在冬枣轮纹病的生物防治方面具有一定的开发应用潜力。

关键词：黄牛毛藓；抑菌作用；大茎点霉；苔藓植物；冬枣

中图分类号 Q948.12 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）23-23-03

Antifungal Effect of Water Extracts from Ditrichum pallidum on Macrophoma kuwatsukai

Liu Junhua 1 et al.

（1Shandong Provincial Engineering and Technology Research Center for Wild Plant Resources Development and Application of Yellow River Delta，Binzhou 256603，China）

Abstract：The antibacterial effect of bryophyte Ditrichum pallidum with its water extraction were studied，which distributed widely in Shandong province. The results indicated that Ditrichum pallidumhad restrain effects on Macrophoma kuwatsukai to a certain extent. And the bacteriostatic effect is more obvious along with the increasing of extraction concentration. At the concentration of 160mg/mL，its inhibition rate on Macrophoma kuwatsukai was more than 70%. As an import medicinal moss species，Ditrichum pallidumhad has certain development value in controlling harmful organism of‘Dongzao jujube.

Key words：Ditrichum pallidum；Antifungal effect；Macrophoma kuwatsukai；Bryophytes；‘Dongzao jujube

苔藓植物种类多样，对环境具有广泛的适应性[1-4]，能够产生如萜类、黄酮类、脂肪酸等次生代谢产物以及一些生物活性物质，是潜在的天然活性产物宝库[3-5]。目前，已有多种苔藓植物被证明有抑制微生物活性的作用[1，4，9-10]。目前，在苔藓植物的应用基础性研究中，抑菌性作用研究仅占了其中的极小一部分，而我国拥有丰富的苔藓植物资源，但有关其抑菌作用的研究仍处于起步阶段。前期研究表明，黄牛毛藓对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、变形杆菌（Proteus vulgris）生长具有一定的抑制作用[9]，但尚未见以植物病原菌为受试菌株的抑菌研究。为此，本试验以黄牛毛藓作为植物材料，以冬枣轮纹病致病菌为受试菌株，利用其黄牛毛藓配子体水提液进行抑菌试验，初步阐明了黄牛毛藓对冬枣轮纹病致病菌的抑制作用及表现出的浓度效应，旨在为以黄牛毛藓为代表的药用苔藓植物资源的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试样品黄牛毛藓（Ditrichum pallid um（Hedw）Hamp.），于2009年春采自山东蒙山（海拔850m处）。

1.1.2 供试菌株本研究所用供试菌株为大茎点霉，由滨州学院生物学试验教学中心提供。大茎点霉是冬枣轮纹病的病原菌[11-12]，该菌属于半知菌亚门Deuteromycotina、腔孢纲Coelomycetes、球壳孢目Sphaeropsidales、球壳孢科Sphaeropsidaceae、大茎点菌属Macrophoma、轮纹大茎点菌Macrophoma kuwatsukaiihara。

1.1.3 培养基及成分本研究采用PDA培养基：马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂20g、蒸馏水1 000mL，pH为自然值。

1.2 研究方法

1.2.1 黄牛毛藓水浸提液母液的制备将黄牛毛藓植物体洗净，以无菌水浸泡至吸水饱和，然后用灭菌滤纸吸去体表多余水分，但不能过重挤压。用电子天平称取8.0g藓体，加少许无菌水，研磨成浆状，再加水至50mL，然后放入50℃恒温水浴锅内浸提24h。以4 000r/min离心10min，收集上清，得上清液即为水提液，然后补水至50mL，即得浓度为160mg/mL的黄牛毛藓配子体水浸提母液。

1.2.2 黄牛毛藓水浸提液的稀释用5mL的无菌移液管吸取160mg/mL的黄牛毛藓水浸提液5mL，沿管壁慢慢注于装含有15mL灭菌蒸馏水的三角瓶中，重复3次，共吸取160mg/mL的黄牛毛藓水浸提液15mL，充分震荡使混合均匀，即得30mL浓度为80.0mg/mL的水浸提液。另取一支无菌移液管，按上述操作方法，作2倍递增稀释，如此每递增稀释1次，即更换1次无菌移液管，依次稀释得到浓度为40.0mg/mL，20.0mg/mL，10.0mg/mL，5.0mg/mL，2.5mg/mL的黄牛毛藓配子体水浸提液。将配制好的藓体水提液置于4℃冰箱保存备用。

1.2.3 大茎点霉活化取大茎点霉的备用菌株，在已杀菌的超将工作台中用接种环各取少许菌苔，接种至PDA固体培养基平板的中央，将已接种大茎点霉的平板置于恒温培养箱中暗培养，即可得到活化的菌株。待其菌落将要长满平板时，即进入下一步操作。

1.2.4 抑菌效果测定采用菌丝生长速率法[1]测定黄牛毛藓水浸提液对大茎点霉生长的影响。将PDA固体培养基在电炉上加热溶化，待冷却后，倒平板。待平板彻底冷却凝固后，在无菌室内用无菌移液枪吸取黄牛毛藓水浸提液200μL，加入已冷却的PDA固体培养基的平板上，火焰灼烧已灭菌的涂布棒，待涂布棒冷却后涂布平板。用无菌打孔器在已活化的大茎点霉的同一生长圈上打孔，得到直径为1cm的菌落块，并移入上述已制备好的平皿中央，每皿一块，用相应的提取溶剂无菌水作对照，每个浓度5次重复。置于28℃恒温培养箱中暗培养。培养3d后，观察大茎点霉的的生长情况，以十字交叉法测量菌落直径。依下式计算抑菌率：

抑菌率（%）=[（对照菌落直径-菌饼直径）-（处理菌落直径-菌饼直径）]/（对照菌落直径-菌饼直径）×100。

1.3 数据的处理与分析试验结果中数据为5个平行样的平均值。均采用Excel 2003进行数据整理，并运用SPSS 18.0统计软件包进行单因素方差分析（LSD多重比较及Duncan's检验）及Pearson相关性分析。

2 结果与分析

2.1 黄牛毛藓水提液的抑菌效果分析本试验采用菌丝生长速率法进行。由表1可知，在较低浓度（2.5mg/mL及5.0mg/mL）下，黄牛毛藓水浸提液对大茎点霉菌丝的生长表现出一定的抑制作用，但抑菌效果不明显；随着黄牛毛藓水浸提液浓度的升高，大茎点霉菌丝生长受到越来越强的抑制，菌落直径迅速减小；当水提液浓度达到20mg/mL时，抑菌率接近50%；而在较高浓度（大于40mg/mL）条件下，大茎点霉菌所受抑制作用明显增强，抑菌率达到60%以上；本试验最高处理浓度（160mg/mL）水提液对大茎点霉菌的抑制率达到70%以上（72.55%）。并且，单因素方差分析表明，黄牛毛藓水浸提液各浓度处理条件下的大茎点霉菌落大小均显著小于对照组。另据观察发现，中高浓度处理下的大茎点霉菌，其菌丝密度小、生长量减少，且菌丝较易老化。

3 讨论与结论

黄牛毛藓俗称金牛毛、刀口药，系牛毛藓科（Ditrichaceae）牛毛藓属（Ditrichumhampe）植物，是我国药用藓类植物中常见的一种[9-10]。该藓全草入药，味淡、性凉，有镇惊、清热凉血及化瘀生肌的功效，多用于治疗小儿惊风、咳血、吐血及跌打损伤等症[9]，在我国民间多有使用。本研究以冬枣轮纹病致病菌为受试菌株，结果表明：黄牛毛藓水粗提液对沾化冬枣轮纹病致病菌大茎点霉的生长具有较强的抑制作用，抑菌强度与浸提液浓度呈显著正相关关系（p<0.05）。但本试验仅是就黄牛毛藓对植物源致病菌抑制作用的初步测定，今后仍需开展深入研究，阐明黄牛毛藓体内次生活性物质的组成成分与含量水平，并进一步优化和筛选提取条件，才有可能制备出抗冬枣轮纹病的植物源杀菌剂，应用到植物病害生物防治的实践中。

参考文献

[1]衣艳君.苔藓植物的抑菌性研究[J].淄博学院学报，2001，3（3）：78-80.

[2]黄士良，李琳，范庆书.河北省药用苔藓资源的初步研究[J].河北师范大学学报（自然科学版），2003，27（6）：23-26.

[3]Asakawa Y.Chemical constituents of Bryophytes[M].In Progress of Phytochemistry，1994，65：12-62.

[4]吴鹏程.苔藓植物生物学[M].北京：科学出版社，1998.

[5]衣艳君.等待开发的国内药用苔藓资源[J].中草药，1999，30（9）：附3-附4.

[6]朱瑞良，王幼芳，熊李虎.苔藓植物研究进展——我国苔藓植物研究现状与展望[J].西北植物学报，2002，22（9）：444-451.

[7]周江渝.苔藓植物的化学活性成分研究概况[J].广西中医学院药学院学报，2001，5（4）：84-87.

[8]马俊改，刘胜祥，王小琴.神农架国家级自然保护区药用苔藓植物的研究[J].中国野生植物资源，2005，24（6）：14-17.

[9]刘俊华，王书平.黄牛毛藓（Ditrichum pallidum）抑菌效果的生物测定[J].湖北农业科学，2010，49（2）：361-362.

[10]赵遵田，曹同.山东苔藓植物志[M].济南：山东科学技术出版社，1998.

[11]季延平，吴玉柱，刘慇，等.冬枣轮纹病病原菌的研究[J].山东林业科技，2005，2：22-23.