常春卫矛提取物体外及体内抑菌作用的试验研究

罗宇东++++张强++++++蒋林++++++李娜

[摘要] 目的 研究常春卫矛水提物、醇提物及5种不同溶剂提取物的抑菌活性。 方法 体外抑菌试验采用试管二倍稀释法联合琼脂平板法，考察常春卫矛水提物、醇提物及5种不同溶剂（石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇）提取物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌的体外抑菌活性；体内抑菌试验以金黄色葡萄球菌为指示菌种，小鼠灌胃分别给予常春卫矛水提物、醇提物14 d，腹腔注射金黄色葡萄球菌，通过观察小鼠死亡率衡量常春卫矛提取物的体内抑菌活性。 结果 体外抑菌试验显示，常春卫矛水提物及醇提物均对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌有一定程度的抑制作用，5种不同溶剂提取物中，甲醇、正丁醇、乙醇乙酯提取物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌有一定程度的抑制作用，石油醚、氯仿提取物无明显抑制作用。体内抑菌试验显示，常春卫矛水提物低（16.0 g/kg）、高（32.0 g/kg）剂量组、醇提物高剂量组（32.0 g/kg）有明显降低金黄色葡萄球菌感染小鼠死亡率的作用（P<0.05）。 结论 常春卫矛提取物具有一定程度的抑菌作用。

[关键词] 常春卫矛；提取物；体内；体外；抑菌作用

[中图分类号] R282[文献标识码] A[文章编号] 1674-4721（2014）06（c）-0009-04

Experimental study in vitro and in vivo antibacterial effect of the extract of Euonymus hederaceus

LUO Yu-dong ZHANG Qiang▲ JIANG Lin LI Na

Pharmaceutical Factory of Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning 530023,China

[Abstract] Objective To investigate antibacterial activity of Euonymus hederaceus water extract,alcohol extract and 5 different solvent extracts. Methods In vitro inhibitory effect of Euonymus hederaceus water extract,alcohol extract and different solvent extracts(petroleum ether,chloroform,ethyl acetate,n-butanol,methanol)on Staphylococcus aureus,Escherichia coli,Salmonella and Pseudomonas aeruginosa were assayed by the method of tube double dilution method combined with agar plate method.In vivo inhibitory effect of the Euonymus hederaceus water and alcohol extraction with Staphylococcus aureus as index,the mice were given Euonymus hederaceus water and alcohol extraction by gavages for 14 days,then the mice were intraperitoneally injected with Staphylococcus aureus suspension.In vivo antibacterial activity of Euenymus hederaceus watder and alcohol extraction was detected respectively by observing the mortality rate in mice. Results Bacteriostatic test in vitro showed that Euonymus hederaceus water extract and alcohol extract on Staphylococcus aureus,Escherichia coli,Salmonella,Pseudomonas aeruginosa had certain degree of restrained.Different solvent extracts of methanol,ethanol,n-butanol,ethyl acetate extract against Staphylococcus aureus,Escherichia coli,Salmonella,Pseudomonas aeruginosa had certain degree of restrained,no obvious inhibition effect of petroleum ether,chloroform extract.Bacteriostatic test in vivo showed that the water extract of Euonymus hederaceus low dose group(16.0 g/kg),high dose group(32.0 g/kg),high dose group of alcohol extract(32.0 g/kg)of the death rate of mice infected with Staphylococcus aureus was markedly decreased. Conclusion Euonymus hederaceus extract has a certain degree of bacteriostatic action.

[Key words] Euonymus hederaceus;Extraction;In vitro;In vivo;Bacteriostatic action

常春卫矛为卫矛科植物常春卫矛（Euonymus hederaceus Champ.Ex Benth）的根、树皮或叶，具有补肝肾、强筋骨、活血止血的功效，临床用于治疗肾虚腰痛、慢性腹泻、跌打损伤、月经不调。国内已开展了常春卫矛抗凝血、活血化瘀、抗炎、镇痛、抗疲劳、免疫增强等作用的药理研究，但有关其抑菌作用的研究尚未见报道[1-3]。本研究观察常春卫矛提取物的抑菌活性，为进一步拓宽常春卫矛的应用范围提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

常春卫矛采自广西壮族自治区资源县，经广西中医药大学药用植物教研室韦松基教授鉴定为卫矛科植物常春卫矛的地上部分。阳性药：阿莫西林胶囊[中诺药业（石家庄）有限公司，国药准字H13021770，批号：257130477，规格：0.5 g]。营养琼脂培养基（北京三药科技开发公司，批号：111205）。营养肉汤培养基（北京三药科技开发公司，批号：121227）。培养基使用时按说明书配制。

1.2 仪器

HV-50自动高压灭菌器（日本Hirayama Manufacturing Corporation）、SW-CJ型超净工作台（苏净集团安泰公司）、SPX-150B-Z生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、AM100电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）、101-2电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）、RE-52A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、恒温水浴锅（上海精密试验设备有限公司）。

1.3 菌株与动物

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠埃希菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、沙门菌（Salmonella）由广西中医药大学第一附属医院微生物实验室提供。昆明种小鼠，体质量（20±2） g，雌雄各半，清洁级，由广西医科大学试验动物中心提供，合格证号：SCXK桂2009-0002。

1.4 方法

1.4.1 常春卫矛提取物的制备①常春卫矛水提物（A）：药材粉碎，用水煎煮2次，1 h/次，煎液过滤，滤液浓缩至浸膏（A），每克浸膏相当于2.0 g药材量，备用。②常春卫矛醇提物（B）：药材粉碎，75%回流提取2次，1 h/次，提取液过滤，回收乙醇，浓缩至浸膏（B），每克浸膏相当于2.0 g药材量，备用。③常春卫矛五倍位提取物（C～G）：药材打成细粉，用60%乙醇浸泡3次，浸泡7 h/次，浸泡液过滤，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩至无醇味，浓缩液再依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取3次，合并萃取液，抽滤，滤液回收溶剂后减压干燥，分别得到常春卫矛石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物；萃取后的剩余稠膏用甲醇溶解，蒸干，为甲醇提取物；每克甲醇（C）、正丁醇（D）、乙酸乙酯（E）、氯仿（F）、石油醚（G）提取物分别相当于14、50、300、200、700 g药材量。以上提取物均由广西中医药大学制药厂提供，临用时配制成试验所需浓度。

1.4.2 常春卫矛提取物体外抑菌试验［4-11］①菌液的制备：挑取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌及沙门菌4个试验菌株的普通琼脂斜面培养基上的单个菌落数个，分别接种于2 ml肉汤管中，37℃培养18～24 h，用无菌生理盐水稀释到菌液浓度为1×106 CFU/ml，备用。②抑菌试验：试管二倍稀释法联合琼脂平板法测定常春卫矛系列提取物的最小抑菌浓度；取装有1 ml营养肉汤培养基试管若干支，按二倍稀释法，将常春卫矛提取物A、B、C、D、E、F、G从第1管进行稀释至第7管，稀释倍数分别为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128，药物浓度分别为80、40、20、10、5、2.5、1.25 mg提取物/ml，每管加相应受试标准菌液各50 μl，充分混均，置37℃培养箱培养18～24 h，考虑到提取物颜色较深，细菌生长后肉眼难以观察或观察的结果易出现偏差，因此再从每一管中取培养物10 μl转种营养琼脂平板培养基上，用L棒涂布，置37℃培养箱培养18～24 h，以不生长菌落的最高药物稀释度为该药物对该种细菌的最小抑菌浓度；平行做3次，以2次或3次相同结果为准。

1.4.3 常春卫矛提取物体内抑菌试验[12-13]①体内抑菌的预试验：取金黄色葡萄球菌备用菌液置无菌瓶中，用无菌生理盐水稀释成不同浓度（1×103～1×108 CFU/ml）的细菌悬液，将上述细菌悬液分别注射于小鼠腹腔，每浓度组6只，注射量0.5 ml，观察小鼠4 d内的死亡情况，选定使小鼠死亡率达80%的菌液浓度为试验注射浓度。②常春卫矛提取物体内抑制金黄色葡萄球菌的试验：取体质量18～22 g的小鼠70只，雌雄各半，按体质量随机分为7组，分别为模型对照组，常春卫矛水提物低（16.0 g/kg）、高（32.0 g/kg）剂量组，常春卫矛醇提物低（16.0 g/kg）、高（32.0 g/kg）剂量组，阿莫西林胶囊组（0.260 g/kg），每组16只。模型对照组灌胃等体积的蒸馏水，其余各组则灌胃相应的药物剂量。各组小鼠连续灌胃给药14 d后，腹腔注射预试验所确定的金黄色葡萄球菌接种浓度，观察并统计4 d内各组小鼠的死亡率，各组小鼠死亡率与模型对照组比较。

1.5 统计学处理

采用 Excel 2003软件进行数据的分析和处理，计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外抑菌试验结果

常春卫矛水、醇提取物对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌有抑制作用，水提物的最小抑菌浓度分别为2.5 mg提取物/ml、5 mg提取物/ml、40 mg提取物/ml、40 mg提取物/ml；醇提物的最小抑菌浓度分别为5 mg提取物/ml、2.5 mg提取物/ml、40 mg提取物/ml、40 mg提取物/ml（表1）。常春卫矛5种溶剂提取物中，甲醇、正丁醇、乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌有抑制作用，甲醇提取物的最小抑菌浓度分别为5 mg提取物/ml、2.5 mg提取物/ml、10 mg提取物/ml、10 mg提取物/ml；正丁醇提取物的最小抑菌浓度分别为5 mg提取物/ml、10 mg提取物/ml、40 mg提取物/ml、20 mg提取物/ml；乙酸乙酯提取物的最小抑菌浓度分别为10 mg提取物/ml、10 mg提取物/ml、40 mg提取物/ml、20 mg提取物/ml；氯仿、石油醚提取物对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌无明显抑制作用（表2）。

表2 常春卫矛5种溶剂提取物对各菌株最小抑菌浓度测定的结果

（mg提取物/ml）

2.2 体内抑菌试验结果

体内抑菌的预试验确定腹腔注射金黄色葡萄球菌接种浓度为1×107 CFU/ml（表3）。常春卫矛水提物低（16.0 g/kg）、高（32.0 g/kg）剂量组及醇提物高（32.0 g/kg）剂量组有明显降低金黄色葡萄球菌感染小鼠死亡率的作用（P<0.05）（表4）。

表3 小鼠腹腔注射金黄色葡萄球菌预试验的结果

表4 常春卫矛提取物对金黄色葡萄球菌感染小鼠的保护作用

与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

卫矛属植物是一类重要的天然药用资源，在世界各地均有分布，在我国民间作为药物使用有悠久的历史，主要用于抗肿瘤、抗炎、抗菌等[14]。本文对常春卫矛提取物的体内及体外抑菌作用进行试验研究，体外抑菌试验采用试管二倍稀释法联合琼脂平板法，考察常春卫矛水提物、醇提物及5种不同溶剂（石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇）提取物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌的体外抑菌活性，结果表明，常春卫矛水提物及醇提物均对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌有一定程度的抑制作用，5种不同溶剂提取物中，甲醇、正丁醇、乙醇乙酯提取物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌有一定程度的抑制作用，石油醚、氯仿提取物无明显抑制作用；体内抑菌试验，常春卫矛水提物低、高剂量组及醇提物高剂理组有明显降低金黄色葡萄球菌感染小鼠死亡率的作用（P<0.05）。

常春卫矛含有卫矛醇、齐敦果烷型五环三萜等成分，国内有关药效作用的物质基础研究较少[15-17]。本研究的体外抑菌试验提示，常春卫矛的水、醇、高极性（甲醇、正丁醇、乙醇乙酯）提取成分的抑菌效果较好，非极性（石油醚、氯仿）提取成分的抑菌效果不明显。常春卫矛是具有研究、开发价值的广西壮、瑶特色药材，但抑菌作用还需进一步研究。

[参考文献]

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[17]黎明，蒋林，雷震鸣.常春卫矛农药残留及重金属含量的分析[J].广西中医学院学报，2010，13（4）：46-48.

（收稿日期：2014-03-22本文编辑：李亚聪）

常春卫矛含有卫矛醇、齐敦果烷型五环三萜等成分，国内有关药效作用的物质基础研究较少[15-17]。本研究的体外抑菌试验提示，常春卫矛的水、醇、高极性（甲醇、正丁醇、乙醇乙酯）提取成分的抑菌效果较好，非极性（石油醚、氯仿）提取成分的抑菌效果不明显。常春卫矛是具有研究、开发价值的广西壮、瑶特色药材，但抑菌作用还需进一步研究。

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[17]黎明，蒋林，雷震鸣.常春卫矛农药残留及重金属含量的分析[J].广西中医学院学报，2010，13（4）：46-48.

（收稿日期：2014-03-22本文编辑：李亚聪）

常春卫矛含有卫矛醇、齐敦果烷型五环三萜等成分，国内有关药效作用的物质基础研究较少[15-17]。本研究的体外抑菌试验提示，常春卫矛的水、醇、高极性（甲醇、正丁醇、乙醇乙酯）提取成分的抑菌效果较好，非极性（石油醚、氯仿）提取成分的抑菌效果不明显。常春卫矛是具有研究、开发价值的广西壮、瑶特色药材，但抑菌作用还需进一步研究。

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[15]蒋林，黎明，雷震鸣，等.常春卫矛质量标准研究[J].中药材，2012，35（1）：50-53.

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[17]黎明，蒋林，雷震鸣.常春卫矛农药残留及重金属含量的分析[J].广西中医学院学报，2010，13（4）：46-48.

（收稿日期：2014-03-22本文编辑：李亚聪）