水红花子花旗松素乙醇回流法提取工艺优化

2013-09-07张雁南杜乾坤范泽慧

食品与机械 2013年3期

刘刚张雁南杜乾坤范泽慧

（吉林工程技术师范学院食品工程学院，吉林长春 130052）

水红花子是红蓼的干燥成熟果实，有健脾消食、化痞散结、清热明目、抑菌等作用［1］。已有研究［1－3］证明，水红花子富含黄酮类化合物，主要成分有槲皮素、花旗松素、3，5，7－三羟基色原酮等。花旗松素（taxifolin）是一种二氢黄酮醇类化台物，化学名为5，7，3′，4′－四羟基二氢黄酮醇［4］。属生物类黄酮拟维生素P，也称黄杉素、紫杉叶素、二氢化槲皮素（di－hydroquercetin，DHQ）［5］。花旗松素具有抗氧化、抗辐射、抗病毒、抗肿瘤、保护细胞内酶等活性作用［4－6］。已作为一种安全的食品添加剂（抗氧剂）被广泛用于植物油、动物油、奶粉、含脂糕点等食品的保鲜，还开发出功能性饮料及相应的食品［5］。市场上的花旗松素大都是以落叶松为原料制得，红蓼分布广泛，是以种子繁殖的一年生草本植物，从其种子水红花子中提取花旗松素不但提高了红蓼的经济价值，也扩大了花旗松素的来源。目前关于花旗松素，特别是水红花子中花旗松素提取工艺研究未见报道。

响应曲面分析法以较少试验次数和较短时间对所选试验参数进行全面研究，在天然药物有效成分提取等领域有广泛应用［7］。本研究以水红花子为原料，利用响应面法对乙醇回流法提取花旗松素的工艺条件进行优化，为水红花子功能成分的开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

水红花子：采自长春市郊，成熟、干燥、形态完整；

无水乙醇、甲醇：分析纯，天津光复精细化工研究所；

花旗松素标准品：纯度≥98%，中国药品生物制品检定所。

1.2 仪器与设备

微型植物试样粉碎机；FZ102型，河北省黄骅市齐家务科学仪器厂；

鼓风干燥箱；DHG－9075A型，上海一恒科学仪器有限公司；

台式循环水式真空泵；SHZ－ⅢA型，郑州英峪领科仪器设备有限公司；

电子天平；AL204型，梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司；

紫外可见分光光度计；S53型，上海棱光有限公司；

水浴锅；HH－S4型，金坛市医疗仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 花旗松素标准曲线的绘制精密称取花旗松素对照品5.0mg，用甲醇溶解于50mL容量瓶中，甲醇定容，作为标准溶液储备液。分别精密吸取 0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL标准溶液储备液于10mL容量瓶中，甲醇定容，以溶剂作空白，在最大吸收波长290nm处用紫外可见分光光度计测各溶液吸光度［8］，绘制标准曲线（见图1），得到标准曲线回归方程：y ＝0.046 1x＋0.001 3，R2＝0.999 6。

图1 花旗松素标准曲线Figure 1 The standard curve of taxifolin

根据回归方程计算样品液中花旗松素的含量，计算水红花子花旗松素的提取量：

1.3.2 花旗松素的提取将水红花子干燥，粉碎，过60目筛。称取5.00g水红花子粉末，加入一定量的乙醇溶液，室温下浸泡30min，之后在一定温度下回流提取一定时间，提取1次，过滤，残渣用相应浓度的乙醇溶液洗涤数次，滤液和洗液转移至250mL容量瓶中，用相应浓度的乙醇定容，再稀释10倍，在290nm处测定吸光度值，计算花旗松素提取量。

1.3.3 试验设计

（1）单因素试验：以花旗松素提取量为评价指标，考察各因素对花旗松素提取量的影响。基础试验条件：水红花子粉末5.00g、乙醇溶液体积分数55%、料液比1∶15（m∶V）、提取温度65℃、提取时间1h、提取1次。单因素试验设计：乙醇溶液体积分数35%，45% ，55%，65%，75% ，85%，95%；提取温度35，45，55，65，75，85，95 ℃；提取时间1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0h；料液比1∶9，1∶12，1∶15，1∶18，1∶21，1∶24，1∶27（m∶V）。

（2）中心组合试验设计：在单因素试验的基础上，采用Design Expert 7.0.0软件，根据 Box－Behnken的中心组合试验设计原理［9，10］，设计3因素3水平的响应面分析试验优化水红花子中花旗松素的乙醇回流提取工艺。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇浓度对花旗松素提取量的影响由图2可知，随着溶剂体积分数的提高，花旗松素提取量增大，体积分数在65%时，提取量达到最大；体积分数继续增大，花旗松素提取量降低。乙醇水溶液随乙醇体积分数的增加而极性减小，花旗松素是多酚羟基化合物［5］，其极性比无水乙醇强比水弱，试验结果说明花旗松素的极性与体积分数65%的乙醇溶液相似。而且随着乙醇浓度增加，脂溶性杂质溶出量增加，对花旗松素吸光度的测定也会存在干扰，因此乙醇体积分数选择在55%～75%较为适宜。

图2 乙醇浓度对花旗松素提取量的影响Figure 2 The influence of ethanol concentration on taxifolin extraction yield

2.1.2 提取温度对花旗松素提取量的影响由图3可知，花旗松素的提取量随着提取温度的提高而增加。温度的升高，有助于传质过程，使分子扩散运动激烈，加快溶质的扩散和溶剂的渗透［11］。温度过高，黄酮类化合物容易被氧化而受到破坏，溶剂容易挥发［12］。综合考虑，提取温度在95℃较为适宜。

2.1.3 提取时间对花旗松素提取量的影响由图4可知，花旗松素提取量随提取时间的增大而增大，当时间达到3h后，随提取时间的增加提取量的提高不明显。这主要是由于随着提取时间的延长，细胞内外浓度达到平衡，活性成分不再溶出［13］。因此，选择提取时间在3h左右较为合适。

图3 提取温度对花旗松素提取量的影响Figure 3 The influence of extracting temperature on taxifolin extraction yield

图4 提取时间对花旗松素提取量的影响Figure 4 The influence of extracting time on taxifolin extraction yield

2.1.4 料液比对花旗松素提取量的影响由图5可知，花旗松素提取量随着料液比的减小先增大，当料液比降到1∶18（m∶V）以后提取量下降。由此可见，增加溶剂用量有利于花旗松素的溶出，但溶剂用量过大，杂质溶出量增加，干扰测定，使提取量下降，同时造成溶剂的浪费。因此选择料液比为1∶15～1∶21（m∶V）较合适。

2.2 响应面法优化提取工艺

2.2.1 响应面设计与结果分析根据单因素试验结果，固定提取提取温度95℃和提取次数1次，以花旗松素提取量为响应值，选取乙醇体积分数、提取温度、料液比为自变量进行响应面分析设计试验（表1）。

表1 中心组合设计的因素与水平Table 1 Variables and levels in central composite design

对所得的试验数据（表2）进行多元回归拟合，得到多元二次回归方程：

表2 中心组合试验方案与结果Table 2 Central composite design matrix and corresponding results

由表3可知，模型达到极显著水平（P＜0.000 1）；方程的失拟误差P＝0.325 3，表现为不显著；模型的相关系数R2＝0.994 3，说明响应值的变化有99.43%来源于所选变量［14］；方差分析结果中，X1、X2、X3、X21、X22、X23对试验结果影响极显著（P＜0.01），X1X2对试验结果影响显著（P＜0.05），其他项不显著；各因素对花旗松素提取量的影响大小，提取时间影响最大，其次是乙醇体积分数，料液比影响最小。

2.2.2 各两因素交互作用对花旗松素提取量的影响响应曲面的坡度越陡峭，表明响应值对因素的改变越敏感。等高线揭示了交互作用的规律，图中等值线密的方向，对应的坐标所表示的因素为交互作用的主要方面［15］。由图6可知，X1和X2交互作用显著，各因素对花旗松素提取量影响的大小顺序为X2＞X1＞X3，这与方差分析结果一致。

2.2.3 花旗松素提取工艺条件的确定由回归模型预测的工艺条件为乙醇体积分数62.52%、提取时间3.37h、料液比1∶19.29（m∶V），预测花旗松素提取量理论值5.95mg／g。为了试验操作简便，调整工艺条件为乙醇体积分数63%、提取时间3.4h、料液比1∶19（m∶V），得到的提取量是5.94mg／g，说明预测值与实际值之间有很好的拟合性，采用响应面法优化得到的花旗松素提取工艺参数准确可靠。

表3 方差分析结果†Table 3 Result of analysis of variance

图6 响应面分析图Figure 6 Response surface

结合上述优化条件，考察提取次数对花旗松素提取量的影响，精密称取5.00g水红花子粉末，反复回流提取3次，收集各次提取液，稀释，在290nm处测定花旗松素溶液的吸光度，计算各处理的花旗松素提取量。

由图7可知，随着提取次数的增加，花旗松素提取量明显下降，3次提取的总提取量为7.42mg／g，第1次的提取量5.94mg／g，第2次的提取量为1.26mg／g，第3次的提取量为0.22mg／g，提取2次的提取量总和为7.2mg／g，占总提取量的97.04%。提取2次后，水红花子中花旗松素残留量已经很少，因此，确定提取次数为2次。综上得出水红花子花旗松素的提取工艺条件为乙醇体积分数63%、提取时间3.4h、料液比1∶19（m∶V）、提取温度95℃、提取2次。