液相色谱－串联质谱法快速测定食品中的乌洛托品

汪 辉 夏立新 彭新凯 王玉枝 杨彦宁 李 莎

（1.长沙市食品质量安全监督检测中心，湖南 长沙 410013；2.湖南大学化学化工学院化学生物传感与计量学国家重点实验室，湖南 长沙 410082）

乌洛托品学名六亚甲基四胺，白色结晶粉末或无色有光泽晶体，几乎无臭，用作树脂和塑料的固化剂、橡胶的硫化促进剂（促进剂H）、纺织品的防缩剂，并用于生产杀菌剂、炸药等［1，2］。乌洛托品水解会生成甲醛和氨气。一些不法商人利用这一性质和甲醛的强杀菌、防腐且能改善外观和质地的作用，将乌洛托品应用于食品的生产，其水解后产生的甲醛使成品色泽光亮，保质期长，以欺骗消费者。消费者食用甲醛后会引起胃痛、呕吐和呼吸困难，并对肝脏、肾脏、中枢神经造成损害，严重的还会导致癌变和畸形病变［3］。目前有报道［4］称不法分子将乌洛托品添加到腐竹中，以延长保质期，使其色泽光亮。腐竹加工过程中添加乌洛托品类似奶粉中添加三聚氰胺，已成为行业中的“潜规则”。

2011年卫生部公布了《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》（第1～5批），其中包括乌洛托品，目前尚无国家标准检测方法，仅有关于检测动物源食品的行业标准，且只适用于鸡肉、鸡肝脏、鸡肾脏和猪肉中乌洛托品残留量的检测和确证。因此建立快速测定食品中乌洛托品的检测方法迫在眉睫。

目前国内外报道的关于乌洛托品的检测方法主要有Nesslerization（奈 氏 比 色 法）［5］、电 位 滴 定 法［6］、电 导 滴 定法［7］、分光光度法［8］、极谱法［9］、高效液相色谱法［10－12］、气相色谱法［13，14］、高效液相质谱串联质谱法［15］。这些方法大部分是药物中乌洛托品的检测方法，关于食品中的乌洛托品的检测方法甚少，其中黄春国［14］采用气相色谱法测定腐竹中的乌洛托品，最低检出浓度为0.7mg／kg，SN／T 2226——2008《进出口动物源性食品中乌洛托品残留量的检测方法液相色谱－质谱／质谱法》采用高效液相质谱串联质谱法测定进出口动物源食品中乌洛托品药物残留，测定低限为5μg／kg。

乌洛托品易水解，所以稳定性试验对建立检测食品中乌洛托品的方法至关重要。通常，稳定性试验采用标准物质配制成一定浓度的溶液做正交试验，在不同条件下分析其浓度变化。当然稳定性试验中乌洛托品浓度的变化并不能代替样品中乌洛托品浓度的变化，但它可以为样品前处理和分析提供相关信息，如乌洛托品在酸性溶液中更易水解和在乙腈溶液中较稳定等。这些信息让我们进一步了解了乌洛托品在食品中的含量变化，也为提高质谱分析方法的灵敏度和更好地优化前处理方法提供向导。

本试验对高效液相色谱条件、特征离子选择、前处理方法技术等方面进行了优化，采用无水硫酸钠干燥净化，乙腈提取，建立了高效液相色谱－串联质谱法测定食品中的乌洛托品的定性和定量的分析方法。该方法灵敏度高，前处理简单，分析周期短，能够有效地及时监控食品中违法添加的乌洛托品。

1 试验部分

1.1 试剂与仪器

乌洛托品：纯度≥99.0%，美国Sigma公司；

甲醇、乙腈：色谱纯，德国Merck公司；

醋酸铵（纯度≥98%）、醋酸（纯度≥99.5%）、甲酸（纯度为98%）、乙醚：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

乙醇（纯度为95%）：分析纯，安徽安特食品有限公司；

Agilent Triple Quad LC／MS：6410型，配有电喷雾（ESI）离子源，美国安捷伦科技有限公司；

高分离度快速液相色谱仪：1200型，配在线脱气机和自动进样器，美国安捷伦科技有限公司；

超声清洗器：KQ3200型，昆山超声仪器有限公司；

氮吹仪：N－EVAP－45型，美国Organomation有限公司；

全自动六通道固相萃取装置：FOTECTOR－06C型，美国睿科仪器有限公司；

超纯水处理器：A10型，美国密理博公司；

水浴恒温震荡器：SHA－B型，江苏金坛医疗仪器厂；

快速混匀器：SK－1型，江苏金坛医疗仪器厂；

台式高速离心机：CT14D型，上海天美生化仪器设备工程有限公司。

1.2 标准溶液的制备

精密称取标准物质乌洛托品于100mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，使成为100mg／L的标准储备液。精密吸取乌洛托品标准储备溶液1.0mL于100mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度使成为1mg／L标准中间溶液，于4℃下避光保存。再逐级稀释配制成质量浓度为1～500μg／L标准工作溶液，标准溶液经0.22μm滤膜过滤，待用。

1.3 LC－MS／MS分析条件

1.3.1 色谱条件 色谱柱为 Agilent Zorbax 300－SCX色谱柱（150mm×2.1mm，5μm i.d.）；柱温为40 ℃；流速为0.4mL／min；流动相 A 为0.01mol／L 醋酸铵（冰醋酸调pH＝3.5），B为乙腈，线性梯度洗脱程序：0～3min，70%A，3～5min，由70%A线性降至20%A，5～8min，20%A，8～8.01min，由20%A线性升至70%A，进样量10μL。

1.3.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源（ESI）；ESI模式：正离子模式；扫描方式：多反应监测（MRM）；毛细管电压：4 000V；雾化器（N2）压力：2.8×105Pa；干燥气体（N2）温度：350℃；干燥气体（N2）流速：9L／min；其他参数见表1。

表1 乌洛托品的MS／MS参数†Table 1 MS／MS parameters of methenamine

1.4 样品处理

1.4.1 前处理方法1 准确称取3.0g样品于50mL离心管中，加无水硫酸钠2.0g，加入乙腈10mL，涡旋混匀2min（含油脂样品加入5mL乙腈饱和正己烷溶液去油），高速离心（10 000r／min，5min），取上清液过0.22μm 尼龙滤膜，滤液待用。

1.4.2 前处理方法2 提取同“前处理方法1：准确称取……高速离心（10 000r／min，5min）”后，转移全部乙腈溶液于10mL比色管中，50℃下氮气吹干，用2mL 0.02mol／L醋酸铵溶解残渣，溶液待用。

依次用3mL甲醇、3mL 0.02mol／L醋酸铵溶液活化PCX固相萃取柱，准确移取待测溶液上柱，控制过柱速度在1mL／min以内，再分别用2mL 0.02mol／L醋酸铵溶液、2mL甲醇淋洗PCX固相萃取柱，抽干后用3mL 5% 氨水－乙腈洗脱，洗脱液在50℃下氮气吹至近干，准确加入1mL乙腈，在快速混匀器上混匀1min，经0.22μm尼龙滤膜过滤，滤液待分析［14，16］。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

毛细管电压、雾化器（N2）压力、干燥器（N2）温度和干燥器（N2）流速的参数均参照安捷伦科技有限公司提供的参考值确定。在流动注射条件和正离子模式下，用浓度为1mg／L的乌洛托品标准溶液，对目标化合物进行母离子扫描，优化毛细管出口电压参数值，再使用优化好的参数进行子离子扫描，优化碰撞能量参数值（见表1）。为了满足欧盟2002／65／EC指令规定，对于禁用药物的质谱确证方法至少需要4个确证点［17］，选择了目标化合物丰度较高，干扰较小的子离子m／z 112，98，85，42进行多反应监测，以m／z 42为定量离子，其可能裂解方式见图1。

图1 乌洛托品的质谱裂解图Figure 1 The proposed fragmentation pathways for methenamine

2.2 色谱分离条件的优化

考察乙腈－醋酸铵（pH＝6.8）、乙腈－醋酸铵（冰醋酸调pH＝5.0）、乙腈－醋酸铵（冰醋酸调pH＝3.5）作为流动相体系。乙腈－醋酸铵（pH＝6.8）作为流动相时，乌洛托品保留时间为1.5min左右，峰型发生严重拖尾现象。随着流动相的pH值降低，乌洛托品的保留值也随之增大，拖尾现象也随之缓解，采用乙腈－醋酸铵（pH＝3.5）作为流动相时，乌洛托品的峰型对称，保留时间为10min以内，较为合理。因此，最终采用乙腈－醋酸铵（pH＝3.5）作为分析乌洛托品的流动相。

确定流动相体系后，采用梯度洗脱方式，可以使分析速度加快，有较好的信号响应，而且避免了内源物质的干扰［18］。考察了流动相0.01mol／L醋酸铵（pH＝3.5）初始比例：80%，70%，60%，50%，按 1.3.1 中 梯 度 洗 脱 时 间，0.01mol／L醋酸铵（pH＝3.5）均降至最低比例（为20%）。结果发现，流动相0.01mol／L醋酸铵（pH＝3.5）初始比例为80%时，响应值最低，其它比例对乌洛托品的分离及响应影响不明显，为了确保流动相足够的离子强度和乌洛托品的响应值，最终选择70%的0.01mol／L醋酸铵（pH＝3.5）作为流动相的初始比例。

确定初始比例后，按1.3.1中梯度洗脱时间，考察了流动相0.01mol／L醋酸铵（pH＝3.5）最终降至的最低比例：40%，30%，20%，10%。结果发现，乌洛托品的响应值、保留时间、峰宽均随着0.01mol／L醋酸铵（pH＝3.5）比例降低而增大，为确保足够的响应值和尖锐的峰型，最终选择20%的0.01mol／L醋酸铵（pH＝3.5）作为流动相降至的最低比例。

2.3 稳定性试验

为更好地了解乌洛托品的稳定性，本试验设计了两个正交试验。

第一个采用L9（34）正交设计试验，考察乌洛托品随着浓度、时间、溶剂和储存环境4个因素发生的变化［19－21］。因素水平表见表2，正交试验及结果分析表见表3。

表2 正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test on autolysis conditions

表3 正交试验L9（34）的结果Table 3 Arrangement and results of L9 （34）orthogonal test

由表3可知，影响乌洛托品标准储备溶液稳定性的因素顺序为A＞B＞D＞C。最优组合为A3B1C3D2。乌洛托品标准储备溶液浓度越大，时间越短越稳定，采用乙腈溶解，冷藏储存较稳定。

乌洛托品溶液被不法份子用来浸泡食品，会产生刺鼻的气味。这是因为乌洛托品水解会生成甲醛。从化学平衡反应方程式（1）可知，增加H＋浓度则促进乌洛托品的水解，增加OH－或浓度则会抑制乌洛托品水解。

由于食品品种不同，不法分子采用乌洛托品溶液浓度、浸泡的时间、酸碱性均不同。模拟食品加工过程乌洛托品的稳定性，乌洛托品溶液随着浓度、浸泡时间、酸碱性3个因素发生的变化。因素水平表见表4，正交试验及结果分析表见表5。

表4 正交试验因素水平表Table 4 Factors and levels of orthogonal test on autolysis conditions

表5 正交试验L9（33）的结果Table 5 Arrangement and results of L9（33）orthogonal test

由表5可知，影响因素对乌洛托品稳定性影响大小分别为C＞B＞A，最优组合为A2B1C3，其测定结果与原始浓度几乎一致。在第5天对这9组溶液进行后续测定，结果发现乌洛托品含量最低降至原来的1%左右。此结果可为测定乌洛托品前处理优化提供指导，也说明用乌洛托品溶液浸泡过后的食品中乌洛托品的含量会因为储存时间的延长而变得非常低，因此要测定食品在加工过程中是否添加乌洛托品需要采用灵敏度非常高的检测方法，本文建立的高效液相色谱串联质谱法测定食品中的乌洛托品，具有高灵敏度，快速、准确等特点，完全满足食品中乌洛托品的定性和定量的测定。

2.4 样品前处理的选择

对比了前处理方法1和2，结果发现方法2因为过固相萃取柱的过程中使用了醋酸铵－水溶液，使得部分乌洛托品水解，且操作步骤较方法1繁琐，商用固相萃取柱批量差异和个体差异以及过柱过程中人为因素影响较大，导致结果的回收率较低（均小于50%）且重复性差（RSD最高达22%）。由于质谱的高选择性，加之本方法采用多个子离子定性，可以有效地消除由于乙腈溶液直接提取且没有净化可能会使样品色谱图有背景干扰的现象。将一定浓度的标准溶液添加至采用方法1处理的样品溶液中，与相同浓度的标准溶液对比响应值，结果发现无明显离子抑制现象。故本方法采用方法1进行样品提取。

2.5 质谱定性与定量

乌洛托品易水解，同一样品在不同时间测定，结果可能不一致。因此，测定乌洛托品质谱定性较定量重要。在相同的仪器条件下，采用双重定性法进行定性，即样品溶液与标准溶液的色谱图保留时间一致，且样品质谱图在扣除背景后所选择的离子均出现，所选择的离子丰度比与标准品一致（相对丰度＞50%，20%～50%，10%～20%，≤10%时，允许的偏差分别为20%，25%，30%，50%），则可判定样品中存在乌洛托品［16，22］。试验监测了乌洛托品母离子141，子离子112，98，85，42，比较了混合空白加标样品溶液各离子的丰度比（见表6）。由表6可知，混合空白加标样品溶液的变异系数、标准偏差和丰度比均得到满意的结果［23］，其离子比例（±25%）为12.5%～19.6%，变异系数（≤15%）为2.4%～13.6%，其典型的图谱见图2。定量分析采用外标曲线法。

2.6 方法学验证

2.6.1 线性关系、线性范围、检出限、定量限、精密度 将乌洛托品标准中间溶液用乙腈稀释成1，2，5，10，20，50，100，200，500，1 000μg／L的标准工作溶液，过0.22μm尼龙滤膜后，直接上机测定，以质量浓度X （μg／L）为横坐标，响应值Y为纵坐标绘制标准曲线。结果显示，乌洛托品在浓度为1～1 000μg／L中线性良好，线性方程为Y＝4.81×102X－6.60×103，r2＝0.998 8。取空白样品基质溶液进行分析，以3倍信噪比（S／N）确定方法的检测限为0.2μg／kg，以10倍信噪比 （S／N）确定方法的定量限为1.0μg／kg。取浓度为100μg／L标准溶液和随机取1份加标样品分别重复进样6次，相对标准偏差（RSD）分别为1.12%和3.63%，表明仪器具有良好的精密度。

2.6.2 回收率和精密度 采用标准加入法测定方法回收率，以鱼仔熟食、湿米粉、腐竹为空白样品基质，分别添加3个浓度水平的标准品，每个浓度水平进行6次重复试验，典型图谱见图3，结果见表7。由表7可知，样品加标回收率在52.6%～118%，RSD小于10.2%。

2.7 干扰试验

为了考察食品中可能违法添加的三聚氰胺、双氰胺和食品中本身含有的多胺类物质，对腐胺、精胺是否干扰乌洛托品进行测定。取三聚氰胺、双氰胺、腐胺和精胺标准品配制成5，50，200μg／L的溶液进样分析；再制成相应浓度的混合样品进样分析。试验结果表明：在本实验所建立的色谱和质谱条件下，三聚氰胺、双氰胺、腐胺和精胺均未检出，表明上述成分对所建立的乌洛托品测定方法无干扰［24－26］。将一定浓度的标准溶液添加至上述溶液中，与相同浓度的标准溶液对比响应值，结果发现含有三聚氰胺、双氰胺、腐胺和精胺的样品溶液对测定乌洛托品无明显基质干扰。

图2 典型总离子色谱图（TIC）和诊断离子色谱图（EIC）Figure 2 The typical total Ion chromatorgraphy and extracted ion chromatogram

表6 LC－MS／MS对样品中乌洛托品的确证分析†Table 6 Summary of confirmation analysis in samples by LC－MS／MS

图3 样品典型色谱图Figure 3 The typical chromatography of samples

表7 样品加标回收率测定结果Table 7 Results of recovery test（n ＝6）

2.8 实际样品测定

对市场抽检的采用国标测定含有甲醛的鱼仔熟食、鸡爪熟食、墨鱼干、鱿鱼干、碱面、湿米粉和不含有甲醛的猪肉、腐竹八类产品进行乌洛托品含量的测定，结果见表8。结果发现，鸡爪熟食中含有0.033mg／kg乌洛托品，其它食品均未检出乌洛托品，但不能排除含有甲醛的样品未添加乌洛托品，因为添加的乌洛托品有可能水解完全。因此，食品中的乌洛托品必须先从食品的生产环节监测，以流通环节辅之。

表8 实际样品测定结果†Table 8 Results of practical samples（n ＝3）／（mg·kg－1）

3 结论

建立了液相色谱－串联质谱法测定食品中乌洛托品的分析方法，采用无水硫酸钠干燥除水，乙腈溶液提取，以0.01mol／L醋酸铵（pH＝3.5）－乙腈溶液为流动相梯度洗脱，SCX色谱柱进行分离，ESI＋／MS进行定性定量检测。本方法快速、准确、特异性强，灵敏度高，样品前处理简便易行，分析周期短，适合大量样品的测定，可用于监测食品中乌洛托品，保护消费者健康。

1 王箴.化工辞典［M］.北京：化学工业出版社，2000：964.

2 M Mohebbi－Fani，S Shekarforoosh，M Maleki，et al.Primary evaluation of methenamine as a NPN compound with probable effects on increasing ruminal escaped protein［J］.J.Vet.Med.A.，2002（49）：239.

3 汪辉，曹小彦，彭新凯，等.高效液相色谱法测定小麦粉与大米粉中甲醛次硫酸氢钠含量的不确定度评定［J］.食品科学，2009，30（12）：205～208.

4 霍键.43吨毒腐竹被查 内含乌洛托品溶液等致癌添加剂［N／OL］.新京报，（2011－11－03）［2011－11－03］.http：／／health.sohu.com／20111103／n324362009.shtml.

5 Bertram W Grlfflths，James E Logan.Determination of methenamine and methenamine mandelate by nesslerization following dilute acid hydrolysis［J］.Anal Chem.，1959（31）：1 882～1 884.

6 Charles A Gaglia，Jr.Leo A Gosser，Lester Chafetz.Methenamine mandelate assay procedures based on a 2：1silver nitratemethenamine complex［J］.Anal Chem.，1972（44）：1 690～1 692.

7 K I Nikolic，K R Velasevic，L S Arsenijevic.Conductometric determination of methenamine［J］.Pharm Week Sci Edi.，1983（5）：28～30.

8 辛志伟，臧志和，赵小玉，等.分光光度法测定乌洛托品的含量研究［J］.数理医药学杂志，2001，14（6）：569.

9 魏小平.一种检测微量乌洛托品的新方法［J］.桂林工学院学报，2005，25（4）：556～558.

10 步雪，张作华，周锦勇.反相HPLC法测定乌洛托品合剂的含量［J］.药学实践杂志，1996，14（1）：49～50.

11 John T Pinto，Jeremy M Van Raamsdonk，Blair R Leavitt，et al.Treatment of YAC128mice and their wild－type littermates with cystamine does not lead to its accumulation in plasma or brain：implications for the treatment of Huntington disease［J］.J.Neurochem，2005（94）：1 087～1 101.

12 李莉，张钢平.高效液相色谱法测定乌洛托品片的含量［J］.中国医院药学杂志，2009（29）：335～336.

13 李薇，陈天科，徐晖，等.乌洛托品的气相色谱分析［J］.分析仪器，2007（3）：29～31.

14 黄春国.气相色谱法测定腐竹中乌洛托品含量的研究［J］.广西轻工业，2008（6）：26～27.

15 国家质量监督检验检疫总局.SN／T 2226——2008进出口动物源性食品中乌洛托品残留量的检测方法［S］.北京：中国标准出版社，2009.

16 陈小华，汪群杰.固相萃取技术与应用［M］.北京：科学出版社，2009.

17 European commission.European Communities No 2002／657／EC implementing council directive 96／23／EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results［DB／OL］.百度文库.（2011－04－20）［2002－08－17］.http：／／wenku.baidu.com／view／2558e0136c175f0e7cd137d2.html

18 汤瑶，李响，闻镍，等.超高效液相色谱－串联质谱法测定大鼠血浆中的磷酸西他列汀［J］.色谱，2011，29（6）：475～480.

19 李宏高，牛育华，南亚，等.发酵型南瓜醋饮料工艺研究［J］.食品科学，2009，30（2）：46～49.

20 汪立平，王锡昌，陈有容，等.啤酒废酵母甘露聚糖的制备［J］.食品科学，2009，30（2）：134～137.

21 Lin Q B，Zhao X T，Song H，et al.Immunoaffinity chromatography purification and ultra－high－performance liquid chromatography－tandem masss pectrometry determination of fourβ－agonists in beef［J］.Food Addit Contam，2012，29（6）：935～941.

22 胡侠，肖光，潘伟，等.高效液相色谱串联质谱法同时测定辣椒粉及辣椒油中的7种罗丹明染料［J］.色谱，2010，28（6）：590～595.

23 Eshaq（Isaac）Shishani，Sin Chii Chai，Sami Jamokha，et al.Determination of ractopamine in animal tissues by liquidchromatography－fluorescence and liquid chromatography／tandem mass spectrometry［J］.Anal Chim Acta.，2003（483）：137～145.

24 肖乐东，唐爱国，莫喜明，等.高效液相色谱－荧光检测法同时测定血清中的犬尿氨酸和犬尿喹啉酸［J］.色谱，2009，27（2）：220～223.

25 王祖项，蒋均，孙莉，等.高效液相色谱－串联质谱法测定食品中的尿素、缩二脲与双氰胺［J］.分析测试学报，2012，31（5）：593～599.

26 杨玉秀，黄和，廖建萌，等.DSPE－HPLC－MS法测定水产品中的三聚氰胺［J］.食品与机械，2012，28（3）：71～75.