植物乳杆菌发酵盐渍辣椒汁培养基及其条件的优化

唐 鑫 夏延斌 吴 灿

（湖南农业大学食品科学技术学院，湖南 长沙 410128）

植物乳杆菌既是生产发酵泡菜、发酵谷物、发酵肉制品等的重要微生物菌群之一［1］，也是人体益生菌［2－4］。其产品因具有改善人体肠道环境和增强机体免疫力等保健功能而受到越来越多的消费者的喜爱［5－9］。湖南是一个辣椒大省，当地的辣椒加工企业在辣椒制品的生产过程中，盐渍辣椒会渗出大量的高含盐量及营养物质丰富的辣椒汁［10］，该汁被当做废液直接排掉，不仅造成营养物质的流失，而且污染环境。目前，乳酸菌最常用的培养基是 MRS培养基，由于MRS培养基的成本比较高，配制麻烦，而且其菌液不是食品级的原料［11］，故不能直接接入食品中用于生产。因此利用盐渍辣椒汁为基质的食品级培养基进行菌种的扩培和种子液的制备，不仅可以节约生产成本，废物利用，保护环境，还可以将种子液直接接种于发酵辣椒制品中，方便生产。同时通过培养基的优化设计可提高菌液中活菌的含量［12］。本试验利用响应面法优化以盐渍辣椒渗出汁为基质的植物乳杆菌培养基，为发酵辣椒制品种子液的制备以及发酵辣椒的生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

盐渍辣椒渗出汁：坛坛香调味品有限公司。

1.1.2 菌种

植物乳杆菌 （L.plantarumP1）：由湖南农业大学食品科技学院食品科学与生物技术湖南省重点实验室保藏。

1.1.3 试剂

MRS肉汤：广东怀凯微生物技术有限公司；

胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、细菌学蛋白胨、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4等：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.4 仪器与设备

恒温培养箱：GZ－250－S型，韶关市广智科技设备发展有限公司；

电子天平：TP－213型，北京赛多利斯仪器系统有限公司；

超净工作台：SW－CJ－1FD型，苏州净化设备有限公司；

立式压力蒸汽灭菌器：WS2－84－64型，上海医用核子仪器厂；

pH计：雷磁PHS－3C型，上海精密科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 盐渍辣椒渗出汁的预处理 将盐渍辣椒渗出汁直接加热蒸发浓缩至原体积的20%，静置冷却以除去底部冷析出来的食盐。再加入蒸馏水使辣椒浓缩汁与水的体积比为1∶4，制得辣椒汁备用。

1.2.2 菌浓度的测定 采用菌落平板计数法［13］测定菌落数，计算发酵液体培养基中的植物乳杆菌浓度。

1.2.3 种子液的制备 转接斜面菌种于 MRS液体培养基中，置于35℃恒温培养箱中静置培养24h，备用。

1.2.4 培养基的优化

（1）不同碳源、氮源、磷源对植物乳杆菌培养的影响：在辣椒汁的基础上，选择蔗糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖4种碳源，质量分数都为4%；选择蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、牛肉膏4种氮源，质量分 数都为2%；选择 K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO44种磷源，质量分数都为0.1%，其他组分均不变进行单因素试验，按2%接种量接入发酵培养基中，初始pH为6.0，培养温度35℃，置于恒温培养箱内静置培养24h，测定培养液的菌浓度并进行比较。

（2）碳源、氮源、磷源的添加量对植物乳杆菌培养的影响：选择上述试验的最佳碳源、氮源、磷源。碳源的质量分数分别选择2%，4%，6%，8%，10%；氮源的质量分数分别选择1%，1.5%，2%，2.5%，3%；磷源的质量分数分别选择0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，进行单因素试验。按2%接种量接种，初始pH为6.0，培养温度35℃，置于恒温培养箱内静置培养24h，测定培养液的菌浓度并进行比较。

（3）响应面法优化发酵培养基：选择上述最佳的碳源、氮源、磷源以及合适的添加量，采用三因素三水平，利用Expert－Design 8.0.5软件，采用 Box－Behnken Design响应面法进行试验设计，以植物乳杆菌培养基菌浓度为评价指标，确定培养基的最优配方。

1.2.5 培养条件的优化

（1）接种量对植物乳杆菌培养的影响：分别选择接种量为1%，2%，3%，4%，5%，接种种子液于已优化的发酵培养基中，初始pH为6.0，培养温度35℃，置于恒温培养箱内静置培养24h，测定培养液的菌浓度并进行比较，选择最佳接种量。

（2）温度对植物乳杆菌培养的影响：按上一步所得的最佳接种量接种种子液于发酵培养基中，初始pH为6.0，分别置于25，30，35，40，45℃恒温培养箱内静置培养24h，测定培养液的菌浓度并选择最适宜温度。

（3）pH值对植物乳杆菌培养的影响：将已优化的发酵培养基pH 值分别调为4.0，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，按最佳接种量接种和最适宜温度静置培养24h，测定其菌浓度进行比较，得到最佳pH值。

1.2.6 生长曲线的测定 根据上述所得的优化后的培养基，按最佳条件培养，每隔3h测定其菌浓度和还原糖的含量，绘制生长曲线［14］。

2 结果与分析

2.1 培养基的优化

图1 碳源对植物乳杆菌菌浓度的影响Figure 1 Effects of carbon sources on bacteria concentration of L.plantarum

图2 氮源对植物乳杆菌菌浓度的影响Figure 2 Effects of nitrogen sources on bacteria concentration of L.plantarum

2.1.1 碳源、氮源、磷源的选择 不同的碳源、氮源、磷源对植物乳杆菌菌浓度的影响见图1～3。由图1可知，当葡萄糖作为碳源时，菌浓度是最高的，可达4.5×1010CFU／mL。而其他糖类作为碳源时差距并不大。可能是因为植物乳杆菌不能利用复杂的碳水化合物［7］，因此葡萄糖作为碳源更适合菌体的生长。因为在菌体的培养过程中，已有报道［1］显示有机氮源比无机氮源更适合菌体的生长，所以本次试验选择了4种有机氮源进行比较。由图2可知，蛋白胨为最适合植物乳杆菌生长的氮源。由图3可知，在4种磷酸盐作为磷源的条件下，K2HPO4为最适合的磷源。综上所述，选择葡萄糖、蛋白胨、K2HPO4分别作为辣椒汁发酵培养基的碳源、氮源和磷源进行添加量选择的单因素试验。

图3 磷源对植物乳杆菌菌浓度的影响Figure 3 Effects of phosphate sources on bacteria concentration of L.plantarum

2.1.2 碳源、氮源、磷源添加量的选择 由图4可知，当葡萄糖的质量分数添加到4%时，菌体浓度随葡萄糖质量分数的增加而提高，当葡萄糖质量分数大于4%时，菌体浓度开始下降，因此选择葡萄糖质量分数4%为最佳添加量；由图5可知，菌体浓度随着蛋白胨质量分数的增加而提高，当蛋白胨质量分数达到2.5%时达到最大值，之后开始下降，因此选择蛋白胨质量分数2.5%为最佳添加量；由图6可知，K2HPO4质量分数为0.2%时，菌浓度达到最大值，可能是因为K2HPO4含量的增加对培养基的pH造成影响所致。

图4 葡萄糖质量分数对植物乳杆菌培养的影响Figure 4 Effects of glucose concentrations on bacteria concentration of L.plantarum

图5 蛋白胨质量分数对植物乳杆菌培养的影响Figure 5 Effects of pepton concentrations on bacteria concentration of L.plantarum

图6 K2HPO4质量分数对植物乳杆菌培养的影响Figure 6 Effects of K2HPO4concentrations on bacteria concentration of L.plantarum

2.1.3 响应面试验设计及结果 在单因素试验基础上进行响应面试验，根据Box－Behnken试验设计原理，以葡萄糖质量分数、蛋白胨质量分数以及K2HPO4质量分数为自变量，菌浓度为响应值对发酵培养基进行优化，试验因素水平编码见表1，设计方案及结果见表2。

表1 辣椒汁发酵培养基响应面试验因素和水平表Table 1 Factors and levels of response surface design／%

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Scheme and results of response surface design

利用 Design－Expert 8.0.5对表中数据进行多元回归拟合并对模型进行方差分析，结果见表3。各因素经二次多项回归拟合后，得到二次多项回归方程：

由表3可知，该模型的复相关系数平方R2＝0.986 0，与校正后相关系数平方R2Adj＝0.967 9接近，说明该模型与实际拟合度好，各具体试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系，因此可以用于模型分析。

表3 回归模型方差分析表†Table 3 Variance analysis of the established regression equation for L.plantarum

由表3回归分析结果可知，模型的F 值为54.67，P＜0.000 1，说明该模型是极显著的。一次项 X1、X2、X3，交互项X1X2，二次项差异均为极显著。失拟项的P＝0.262 8，说明失拟项在0.05水平上不显著，残差均由随机误差引起。因此可利用该回归模型对试验结果进行优化分析，确定植物乳杆菌辣椒汁发酵培养基的最佳配方。

2.1.4 响应面分析及优化 响应面分析方法的图形是特定的响应面对应的因素葡萄糖质量分数、蛋白胨质量分数、K2HPO4质量分数所构成的三维空间图。曲面图的形状可反应出各个因素对菌浓度的影响，曲面越陡峭，影响越显著［15］。由图7可知，三因素值选择合理，验证了模型的准确。为进一步确定培养基的最佳配比，用Design－Expert 8.0.5软件进行数值优化分析，获得最优的配比为葡萄糖质量分数3.51%、蛋白胨质量分数2.13%、K2HPO4质量分数0.22%，在此条件下得到菌浓度的理论值为4.93×1010CFU／mL。实际操作进行3次平行验证实验，结果得到培养液菌浓度为4.79×1010CFU／mL，与理论值较为吻合。

2.2 培养条件的选择

由图8可知，当接种量在2%时菌浓度最高，随着接种量增加，菌体生长效果受到影响，可能是因为发酵初期培养基中的营养物质不能满足过量植物乳杆菌的生长所需；这是由于接种进该研究中的培养基即一般MRS培养基的菌浓度本身不高于本培养基优化后的浓度，且当接种量过高时，该培养基并不适于植物乳杆菌的生长，使其生长所需营养物质不足，所以当接种量过高时，菌种会出现生长缓慢导致的菌浓度偏低现象，并非抑菌现象。由图9可知，在35～40℃时，菌体浓度较高，可能是因为过低的温度会降低酶活力使菌体生长较慢，而过高的温度则会使细胞内蛋白质变性影响菌体的生长；由图10可知，在pH为6.5时，菌体生长最好，所以最佳pH应控制在6.5左右。

2.3 生长曲线的测定

确定培养基的配比和培养条件后，用最佳培养基配方和最适宜生长条件培养植物乳杆菌，绘制其生长曲线及还原糖含量变化曲线，见图11。由图11可知，植物乳杆菌在辣椒汁发酵培养基上约在6h后进入对数生长期，当培养时间到达21h左右时，菌体生长进入稳定期，27h后菌体逐渐开始衰亡。由此可得，菌株的种龄为21h，发酵周期为27h，在优化后的条件下，活菌数可以达到4.9×1010CFU／mL。

3 结论

本试验在单因素试验基础上，通过响应面法对植物乳杆菌发酵盐渍辣椒渗出汁培养基进行优化，并得到回归方程。经分析，确定培养基的最佳配方为葡萄糖质量分数3.51%、蛋白胨质量分数2.13%、K2HPO4质量分数0.22%，在此条件下的平均实际菌浓度为4.79×1010CFU／mL，与理论值4.93×1010CFU／mL接近。并在此基础上进一步研究其培养条件，在接种量2%、培养温度35℃、初始pH 6.5、发酵时间21h后，菌浓度可达到4.9×1010CFU／mL。此时该发酵液用于发酵辣椒制品效果最好。

图7 各两因素交互作用对发酵培养基菌浓度影响的响应面及等高线图Figure 7 Response surface and contour plots showing the interactive effects of three parameters on the bacteria concentration of fermentation medium

图8 接种量对植物乳杆菌菌浓度的影响Figure 8 Effects of inoculation amount on bacteria concentration of L.plantarum

图9 培养温度对植物乳杆菌菌浓度的影响Figure 9 Effects of culture temperature on bacteria concentration of L.plantarum

图10 pH值对植物乳杆菌菌浓度的影响Figure 10 Effects of pH on bacteria concentration of L.plantarum

图11 植物乳杆菌生长曲线及还原糖含量的变化Figure 11 Growth curve of L.plantarumand change of sugar content

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