产柚苷酶高产菌株的筛选

刘艺文 刘素纯

（湖南农业大学食品科学技术学院，湖南 长沙 410128）

中国是世界柑橘四大原产地之一，年产量约为1 500万t，居世界第三。柑橘经深加工后会出现明显的苦味，难以去除。脱除苦味的方法有很多种，如：物理方法、化学方法等。这些方法都存在各种问题，如：脱苦效率不高、操作复杂等［1］。利用微生物产生相对应的酶来脱除柑橘中的苦味物质的方法，不但脱苦效率高，而且还不会影响柑橘特有的风味，操作方法也比较简便，是目前最具有前景和潜力的方法［2，3］。柑橘深加工中主要的苦味物质是柚皮苷，柚皮苷的分解酶——柚苷酶的生产国内外也早有研究［4～6］，但一直未能应用到实际工业生产当中，探究其主要原因是因为缺少发酵产酶性能稳定的高产柚苷酶菌株。本试验拟从大量腐烂的柑橘内筛选出产柚苷酶的高产菌株，为柑橘的深加工提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验原料

橘皮粉：60目，本实验以湖南石门产色泽光鲜、个体饱满、成熟度高的柑橘橘皮制备；

脱脂豆饼粉：市售；

豆渣：含水量30%～35%，市售。

1.1.2 主要试剂

柚皮苷：含量98%，美国Sigma公司；

一缩二乙二醇：CP级；长沙化学试剂公司；

Davis柚苷显色液（DES）：本实验室根据［7］制备。

其他试剂：AR级，长沙化学试剂公司。

随着光电设备日渐趋于小型化、精密化和高性能化，使其成为可折叠的便于携带的产品.因此，对透明导电薄膜质量的要求越来越高，进而对薄膜制备工艺的要求也越来越高.尽管AgNWs薄膜具有许多突出的优点，但是如何在高透光率下获得低的片电阻仍然是一个挑战，这是亟待解决的问题.AgNWs网络的电导性明显取决于AgNWs之间的连接.以传统方法制备的AgNWs网络存在较大的接触电阻和接触稳定性问题，不利于电子设备的精细化应用.为了降低片材电阻，研究人员提出了几种有效的AgNWs焊接方法，包括激光束焊接[17]、化学焊接[18]、电阻焊接[19]及冷焊[20]等.

1.1.3 培养基的制备

（1）斜面培养基：MgSO4·7H2O 5g，橘皮粉10g，K2HPO45g，KCl 5g，FeSO4·5H2O 0.1g，琼脂粉20g，蒸馏水1 000mL，四环素片适量，自然pH，0.1MPa蒸汽灭菌20min。

（2）平板筛选培养基：MgSO4·7H2O 5g，橘皮粉10g（在水中煮沸，30min后用纱布过滤）K2HPO45g，KCl 5g，FeSO4·5H2O 0.1g，琼脂粉20g，蒸馏水1 000mL，四环素片适量，自然pH，0.1MPa蒸汽灭菌20min。

（3）种子培养基：鼠李糖0.2g，脱脂豆饼粉40g，豆渣（含水量30%～35%）100g蒸馏水1 000mL，0.1MPa蒸汽灭菌20min。

（4）产酶摇瓶发酵培养基：鼠李糖0.2g，脱脂豆饼粉40g，豆渣（含水量35%～40%）100g蒸馏水1 000mL，0.1MPa蒸汽灭菌20min，300mL三角瓶装液量100mL。

1.2 试验方法

1.2.1 柚苷酶产生菌的分离 从不同地方腐烂的柑橘中采样20份，每份样品25g和225mL生理盐水，适量玻璃珠一起放入无菌的500mL三角瓶中，摇床培养振荡30min，充分打散菌体后，用10倍稀释法将菌液稀释到10－8，将10－4～10－8稀释液各0.1mL分别涂布于平板筛选培养基上，30℃恒温培养3～5d（3d后每天进行观察）。挑选出有明显菌落特征的平板，并对菌落所在平板进行编号，选取生长状况良好的单个菌落接入斜面培养基，放入30℃恒温培养箱。

将DES以相同的厚度滴加在挑选过菌落的平板上，于40℃条件下反应20min后，将残留液体倒去，观察平板内培养基的显色反应，并对对应斜面试管重新编号，筛选出具有产柚苷酶能力的菌株，于0℃冰箱保存。

1.2.2 柚苷酶产生菌的初步筛选 先将分离得到的菌株接种于平板筛选培养基上，30℃恒温培养3～5d。再将DES滴加在平板上，40℃恒温条件下反应20min，然后将残液倒去，这时在平板中柚苷酶产生菌周围会出现清晰可见的透明圈，测量平板中透明圈的大小，根据菌落周围出现的透明圈大小，即可初步判断菌株产柚苷酶能力的高低，作为下一步复筛的出发菌株。

1.2.4 平板透明圈测定方法 将DES以正好覆盖整个平板的厚度滴加在挑选完菌落的平板培养基上，40℃恒温条件下反应20min后，将残留液倒去。如果菌落周围出现清晰可见的透明圈，说明该菌落有水解柚皮苷的柚苷酶的存在，而柚苷酶酶活的高低由透明圈直径与菌落直径之比HC值［8］来确定。

1.2.5 柚苷酶酶活力的测定 采用中林改良Davis法［9］。

1.2.6 粗酶液的制备 发酵液先经棉纱布过滤，后用离心机8 000r／min离心20min，所得到的上清液即为粗酶液。

1.2.7 柚皮苷标准曲线的绘制 先配置0.05mg／mL的柚皮苷溶液，分别取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2mL柚皮苷溶液于试管中备用，依次加入2.45mL DES，然后用蒸馏水定容至5mL，于30℃水浴保温30min，在420nm波长下测定吸光度，以吸光度A420对标液柚皮苷含量的微克数作图，得到标准曲线。

1.2.8 柚苷酶产生菌的初步鉴定

（1）菌株的菌落特征观察：无菌操作挑取少量孢子点接于PDA平板培养基中央，28℃条件下恒温培养，每隔12h观察菌落生长状态，生长速度和颜色变化。

（2）插片法个体形态观察：无菌操作取15mL PDA培养基倒平板，待培养基快凝固后，将0.5mL菌悬液涂布在培养基表面，再以无菌操作用镊子将无菌盖玻片以45°角插入培养基内，将平板倒置，30℃恒温培养箱内培养。待2d左右开始进行个体形态观察。用镊子拔出盖玻片，将其用棉兰染色进行镜检。

2 结果与分析

2.1 柚苷酶产生菌的分离

以橘皮粉为培养基质，利用具有产柚苷酶能力的菌落可以和平板培养基发生显色反映，形成清晰可见的透明圈的原理，从腐烂的柑橘内分离得到150株产柚苷酶的菌株，产柚苷酶的菌株见图1。

图1 显色反应后产生透明圈图Figure 1 The color reaction to produce transparent circle diagram

2.2 菌种初筛结果

对分离获得的菌株用平板透明圈法来初步判定产柚苷酶能力的高低，先将每个初筛菌株点接于平板筛选培养基上于30℃恒温条件下培养3d，通过测量透明圈的直径和菌落直径来计算HC值，将HC值大于1.4的菌株进行斜面保存，共得到24株产柚苷酶较高的菌株，表1为筛选的到的24个单菌落的HC值，菌株按HC值由高到低排列。

2.3 菌种复筛结果

2.3.1 柚皮苷标准曲线的绘制 酶活力的测定采用中林改良Davis法测定，柚皮苷的标准曲线为y＝0.034 8x－0.023 8，R ＝0.998 2（见图2）。

2.3.2 柚苷酶产生菌复筛结果 通过平板透明圈法中HC值的比较，选取HC值最高的10个菌株进行摇瓶发酵测定其酶活力，每个菌株设3个重复，根据标准曲线方程计算，酶活力测定结果见表2。

由表2可知，菌株D7，J9，B1较其他菌株有更高产柚苷酶能力，其中D7菌株产柚苷酶能力最高，其发酵液酶活力为291.41U，中国国内自然筛选柚苷酶菌株其酶活力一般为50～200U［10］，因此认为菌株D7有较高酶活力。

2.4 菌种初步鉴定

菌落呈黑色，菌丝短被黑色孢子覆盖，培养基颜色。气生菌丝无隔膜；分生孢子梗疏松；有足细胞；分生孢子梗较粗无分枝，顶囊大球形，小梗双层，分生孢子为球形，呈黑、黑褐色（见图3）。

表1 菌落的HC值Table 1 Colonies of HC value

图2 标准曲线Figure 2 The standard curve

根据《真菌鉴定手册》［11］中关于黑曲霉的描述，结合菌落、菌丝和孢子等形态特征，初步鉴定D7菌株为黑曲霉属。

3 结论

透明圈法筛选柚苷酶产生菌，是利用在柚苷酶产生菌周围能形成清晰可见的透明圈，并且根据HC值的大小就能初步判定产柚苷酶能力的高低的特点，提高筛菌的效率。以橘皮粉为培养基质，对堆积腐烂的柑橘表皮采用稀释平板法和透明圈法筛选出一株柚苷酶生产菌株D7。通过菌落和形态特征观察并对照《真菌鉴定手册》上关于黑曲霉的描述，初步鉴定为黑曲霉。对该菌株进行摇瓶发酵测其酶水平达到291.41U，该菌株具有较强的降解柚皮苷能力。

表2 复筛菌株的柚苷酶酶活力Table 2 Naringinase activities of repeated screening strains

图3 菌株D7培养3d的菌落形态和个体形态（放大倍数400）Figure 3 Colony of D7cultivated 3dand individual morphology under the microscope（magnification＝400）

1 姚辉.产柚苷酶菌株的选育及柚子汁酶法脱苦工艺的研究［D］.福州：福建农林大学，2009.

2 曾凡坤，邹连生，焦必林.柑桔中类柠檬苦素含量及分布研究［J］.中国食品学报，2003（4）：8～11.

3 单杨，李高阳.现代生物技术在柑橘工业应用的研究进展［J］.食品与机械，2007，23（5）：141～144.

4 张怡，曾红亮，姚辉，等.柚苷酶产生菌的分离筛选及鉴定［J］.中国食品学报，2012，12（2）：196～201.

5 张怡.福建特产柚子加工及综合利用技术的研究［D］.福州：福建农林大学，2009.

6 杨昌鹏.酶制剂的生产与应用［M］.北京：中国环境科学出版社，2006.

7 郭倩.产柚苷酶高产菌株的筛选，鉴定及产酶特性研究［D］.成都：四川农业大学，2008.

8 Palm Banerjee S.Production，purification and characterization of the debittering enzyme naringinase［J］.Biotechnology Advances，2000，18：207～217.

9 吴长庆.柑橘果汁中的苦味物质及其去除方法［J］.中国商办工业，2000（2）：53～54.

10 Munish Puri，Sukirti Kalra.Purification and characterization of naringinase from a newly isolated strain of Aspergillus nigerl 344for the transformation of flavonoids［J］.World Journal of Microbiology Biotechnology，2005（21）：753～758.

11 魏景超.真菌鉴定手册［M］.上海：上海科技出版社，1979.